Singolo ovociti Mutagenesi bisolfito
Summary
Mutagenesi bisolfito è il gold standard per l'analisi della metilazione del DNA. Il nostro protocollo modificato per l'analisi consente di metilazione del DNA al livello di singola cellula ed è stato specificamente progettato per i singoli ovociti. Può anche essere utilizzato per il clivaggio stadio embrioni.
Abstract
L'epigenetica comprende tutte ereditarie e le modifiche reversibili alla cromatina che l'accessibilità alter gene, e quindi sono i principali meccanismi per la regolazione della trascrizione genica 1. Metilazione del DNA è una modificazione epigenetica che agisce prevalentemente come un segno repressivo. Attraverso l'aggiunta covalente di un gruppo metilico su citosine in dinucleotidi CpG, può assumere altre proteine repressivi e modifiche istone avviare processi di condensazione della cromatina e il silenziamento genico 2. Metilazione del DNA è essenziale per il normale sviluppo in quanto svolge un ruolo fondamentale nella programmazione dello sviluppo, differenziamento cellulare, la repressione degli elementi retrovirali, inattivazione del cromosoma X e imprinting genomico.
Uno dei metodi più potenti per l'analisi della metilazione del DNA è mutagenesi bisolfito. Bisolfito di sodio è un mutageno DNA che deamina cytosines in uracils. Dopo l'amplificazione PCR e seque ncing, questi eventi di conversione vengono rilevati come thymines. Citosine metilate sono protetti da deaminazione e quindi rimangono come citosine, che consente l'identificazione di metilazione del DNA a livello di singolo nucleotide 3. Sviluppo del saggio mutagenesi bisolfito è avanzato da quelli originariamente riportati 4-6 verso quelli che sono più sensibili e riproducibile 7. Un progresso fondamentale è stato l'incorporamento piccole quantità di DNA in un cordone di agarosio, proteggendo in tal modo il DNA dal trattamento bisolfito duro 8. Questa analisi di metilazione in grado di essere eseguita su pool di ovociti e di embrioni allo stadio di blastocisti 9. Il più sofisticato protocollo di mutagenesi bisolfito ad oggi è per i singoli embrioni allo stadio di blastocisti 10. Tuttavia, poiché blastocisti hanno in media 64 celle (contenente 120-720 pg di DNA genomico), questo metodo non è efficace per gli studi sulla metilazione ovociti individuali o clivaggio stadi embrioni.
tenda "> Assunzione di indizi da incorporare agarosio di somme di DNA minuto tra cui 11 ovociti, qui vi presentiamo un metodo per cui gli ovociti vengono direttamente incorporati in una soluzione di agarosio e lisi cordone immediatamente dopo il recupero e la rimozione della zona pellucida dell'ovocita dal. Questo ci permette di bypassare le due sfide principali di mutagenesi singolo ovocita: bisolfito. proteggere una piccola quantità di DNA dalla degradazione, e conseguente perdita durante le fasi di protocollo numerosi importante, poiché i dati sono ottenuti da ovociti singoli, il problema del bias PCR in pool Inoltre viene eliminato. , contaminazione accidentale cella cumulo rilevabili mediante questo metodo poiché ogni campione con più di un pattern di metilazione può essere esclusi dall'analisi 12. Questo protocollo fornisce un metodo migliorato per analisi di successo e riproducibile di metilazione del DNA a livello di singola cellula ed è ideale ovociti per i singoli così come scissione stadio embrioni.Protocol
Discussion
Questo saggio ovocita singolo contiene molti passi con un numero che sono critiche e richiedono particolare attenzione. Il primo è lavaggio ovocita. È particolarmente importante lavare ciascun ovocita più volte in mezzo fresco scende dopo il trattamento ialuronidasi per rimuovere come cellule del cumulo numero possibile. Inoltre, durante il trasferimento di ovociti alla soluzione acida Tyrode per la rimozione della zona pellucida assicurarsi che circonda mezzo è chiaro cellule del cumulo. L'ovocita è molto appi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla University of Western Ontario, il Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia, e una borsa di ER06-02-188 da Ministryof di ricerca e innovazione, Premio ricercatore alle prime armi. MMD è stata sostenuta da un programma di formazione CIHR in riproduzione, lo sviluppo precoce e l'impatto sulla salute (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
References
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