Summary
Hydrogensulfit mutagenese er den gyldne standard for analyse af DNA methylering. Vores modificeret protokol giver mulighed for at DNA-methylering analyse på enkelt-celle niveau, og er specielt designet til individuelle oocytter. Det kan også anvendes til spaltning-embryoer.
Abstract
Epigenetik omfatter alle arvelige og reversible ændringer af kromatin, der ændrer gen tilgængelighed, og dermed er de primære mekanismer til at regulere gentranskription 1. DNA methylering er en epigenetisk modifikation, der fungerer overvejende som en undertrykkende mærke. Gennem den kovalente addition af en methylgruppe på cytosiner i CpG-dinukleotider, kan det rekruttere yderligere undertrykkende proteiner og histon modifikationer til at indlede processer involveret i kondenserende chromatin og silencing gener 2. DNA metylering er essentiel for normal udvikling som den spiller en kritisk rolle i udviklingsmæssige programmering, celledifferentiering, undertrykkelse af retrovirale elementer, X-kromosom inaktivering og genomisk prægning.
En af de mest effektive metoder til DNA-methylering analyse bisulfit mutagenese. Natriumbisulfit er en DNA mutagen som deaminerer cytosiner i uraciler. Efter PCR-amplifikation og seque ncing, er disse konvertering begivenheder registreret som thyminer. Denatureret cytosinerne er beskyttet mod deaminering og dermed forblive som cytosinerne, muliggør identifikation af DNA methylering på det enkelte nukleotid niveau 3. Udvikling af bisulfit mutagenese assayet er frem fra de oprindeligt rapporterede 4-6 til dem, der er mere følsomme og reproducerbare 7. Et centralt avancement blev indlejre mindre mængder af DNA i en agaroseperle, og derved beskytte DNA fra den barske behandling med bisulfit 8. Dette aktiveret methylering analyse, der skal udføres på puljer af oocyter og blastocyst-stadie embryoner 9. Den mest avancerede hydrogensulfit mutagenese protokol til dato er for de enkelte blastocyst-embryoer 10. Men da blastocyster har i gennemsnit 64-celler (indeholdende 120-720 pg genomisk DNA), er denne fremgangsmåde ikke effektiv til methylering undersøgelser individuelle oocytter eller spaltning embryoer.
telt "> tage spor fra agarose indlejring af små DNA-mængder, herunder oocytter 11, her præsenterer vi en metode, hvor oocyter er direkte indlejret i en agarose og lysis løsning perle umiddelbart efter hentning og fjernelse af zona pellucida fra oocyt. Det gør os i stand til at omgå de to vigtigste udfordringer i en enkelt oocyt hydrogensulfit mutagenese:. beskytter et minut mængde af DNA fra nedbrydning og efterfølgende tab i løbet af de mange protokoller trin vigtigt, da data er indhentet fra enkelte oocyter, er spørgsmålet om PCR skævhed i pools elimineret Endvidere. , utilsigtet Cumulus celle forurening er påviselig ved denne metode, da enhver prøve med mere end en methylering mønster kan udelukkes fra analyse 12. Denne protokol giver en forbedret metode til succesfulde og reproducerbar analyser af DNA methylering på enkelt-celle niveau og er ideel individuelle oocytter samt spaltning embryoer.Protocol
Discussion
Denne ene oocyt analysen indeholder mange trin med et nummer, der er kritiske og kræver særlig pleje. Den første er oocyt vask. Det er især vigtigt at vaske hver oocyt flere gange i frisk medium falder efter hyaluronidase behandling for at fjerne så mange cumulusceller som muligt. Endvidere, når der overføres oocytterne til sur Tyrodes opløsning zona pellucida fjernelse sørge omgivende medium er fri af cumulusceller. Den oocyt er meget klistret efter zona fjernet, og eventuelle omkringliggende cumulusceller kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af University of Western Ontario, Institut for obstetrik og gynækologi, og et tilskud ER06-02 til 188 fra Ministryof Forsknings-og Innovationsstyrelsen, Early Researcher Award. MMD blev støttet af en CIHR Training Program i reproduktion, Tidlig udvikling og indflydelse på sundheden (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l. Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
