Single Eicel bisulfiet Mutagenese
Summary
Bisulfiet mutagenese is de gouden standaard voor het analyseren van DNA-methylatie. Onze gewijzigde protocol zorgt voor een DNA-methylatie analyse op de single-cell niveau en is speciaal ontworpen voor individuele eicellen. Het kan ook worden gebruikt voor splitsing-embryo's.
Abstract
Epigenetica omvat alle erfelijke en reversibele aanpassingen van chromatine, dat alter gen toegankelijkheid, en dus zijn de belangrijkste mechanismen voor het reguleren van gentranscriptie 1. DNA-methylatie is een epigenetische modificatie die voornamelijk fungeert als een repressieve merk. Door de covalente toevoeging van een methylgroep op cytosines in CpG dinucleotiden, kan het werven extra repressieve eiwitten en histon-modificaties aan processen die betrokken zijn in condenserende chromatine en zwijgen genen 2 te starten. DNA-methylatie is essentieel voor normale ontwikkeling, want het speelt een cruciale rol in het ontwikkelings-programma's, celdifferentiatie, onderdrukking van retrovirale elementen, X-chromosoom inactivatie en genomic imprinting.
Een van de meest krachtige methoden voor DNA methylatie analyse is bisulfiet mutagenese. Natriumbisulfiet is een DNA-mutageen dat cytosines deaminates in uracils. Na PCR-amplificatie en Seque ncing, worden deze conversie gebeurtenissen gedetecteerd als thymines. Gemethyleerde cytosines worden beschermd tegen deaminering en dus blijven cytosines, waardoor de identificatie van DNA-methylatie op individueel nucleotide niveau 3. De ontwikkeling van de bisulfiet mutagenese test in een vergevorderd stadium van de oorspronkelijk gemelde 4-6 de richting van degenen die meer gevoelig en reproduceerbaar 7. Een belangrijke verbetering is het inbedden van kleinere hoeveelheden DNA in een agarose kraal, waardoor de bescherming van DNA van de harde bisulfiet behandeling 8. Hierdoor konden methylatie analyse worden uitgevoerd op zwembaden van eicellen en het blastocyst-stadium embryo's 9. De meest geavanceerde bisulfiet mutagenese protocol tot op heden is aan de individuele blastocyst-embryo's 10. Aangezien blastocysten hebben gemiddeld 64 cellen (die 120 tot 720 pg van DNA), deze methode niet doeltreffend voor methylering studies individuele oöcyten of splitsing-embryo's.
tent "> Met aanwijzingen van agarose inbedding van minuut DNA-bedragen inclusief eicellen 11, hier presenteren wij een methode waarbij eicellen direct zijn ingebed in een agarose en lysis oplossing kraal onmiddellijk na het ophalen en verwijderen van de zona pellucida van de eicel. Dit stelt ons in staat omzeilen de twee belangrijkste uitdagingen van een eicel bisulfiet mutagenese:. bescherming van een geringe hoeveelheid DNA van degradatie, en de daarop volgende verlies tijdens de vele stappen protocol is belangrijk, aangezien de gegevens zijn verkregen van enkele eicellen, de kwestie van de PCR-vertekening in zwembaden wordt geëlimineerd Verder. , onopzettelijke cumulus cellen besmetting is detecteerbaar met deze methode, omdat een monster met meer dan een methylatie patroon kan worden uitgesloten van de analyse 12. Dit protocol biedt een verbeterde methode voor een succesvolle en reproduceerbare analyses van DNA-methylatie op de single-cell niveau en is bij uitstek geschikt individuele eicellen en splitsing-embryo's.Protocol
Discussion
Deze ene eicel test bevat een groot aantal stappen met een aantal die kritisch zijn en vereisen speciale zorg. De eerste is eicel wassen. Het is bijzonder belangrijk voor elke eicel wassen meerdere malen in vers medium daalt na hyaluronidase behandeling om zoveel cumuluscellen mogelijk. Bovendien, wanneer de overdracht van eicellen om de oplossing te zure tyrode voor zona pellucida verwijderen zorg ervoor dat omringende medium vrij is van cumulus cellen. De eicel is zeer kleverig na zona verwijderen, en alle omringende …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Western Ontario, de afdeling Obstetrie en Gynaecologie, en een subsidie ER06-02-188 uit de Ministryof onderzoek en innovatie, Early Onderzoeker Award. MMD werd ondersteund door een CIHR Training Program in de voortplanting, de vroege ontwikkeling en de impact op gezondheid (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l. Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
