Simple mutagenèse bisulfite d'ovocytes

Summary

Mutagenèse bisulfite est l'étalon-or pour l'analyse de méthylation de l'ADN. Notre protocole modifié permet une analyse méthylation de l'ADN au niveau unicellulaire et a été spécialement conçu pour les ovocytes individuels. Il peut également être utilisé pour le clivage-embryons au stade.

Abstract

L'épigénétique englobe toutes héréditaires et des modifications réversibles de la chromatine que l'accessibilité des gènes alter, et sont donc les principaux mécanismes de régulation de la transcription du gène ^1. Méthylation de l'ADN est une modification épigénétique qui agit principalement comme une marque de répression. Grâce à l'addition covalente d'un groupement méthyle sur les cytosines dans les dinucléotides CpG, on peut recruter d'autres protéines de répression et les modifications des histones pour lancer le processus impliqués dans la condensation de la chromatine et faire taire des gènes ^2. Méthylation de l'ADN est essentielle pour le développement normal car elle joue un rôle essentiel dans la programmation du développement, la différenciation cellulaire, la répression des éléments rétroviraux, inactivation du chromosome X et l'empreinte génomique.

Une des méthodes les plus puissants pour l'analyse méthylation de l'ADN est la mutagenèse bisulfite. Bisulfite de sodium est un agent mutagène ADN qui désamine cytosines en uraciles. Après amplification par PCR et seque ncing, ces phénomènes de conversion sont détectés comme thymines. Cytosines méthylées sont protégés de la désamination et restent donc en cytosines, permettant l'identification de la méthylation de l'ADN au niveau individuel nucléotide ^3. Développement de l'essai de mutagenèse bisulfite a progressé de ceux initialement déclarés ^4-6 vers ceux qui sont plus sensible et reproductible ^7. Un progrès important a été l'incorporation de petites quantités d'ADN dans un bourrelet d'agarose, protégeant ainsi l'ADN provenant du traitement bisulfite dure ^8. Cette analyse de la méthylation permis à être exécuté sur des pools d'ovocytes et embryons au stade ^{blastocyste-9.} Le protocole le plus sophistiqué du bisulfite de mutagenèse à ce jour est pour individuels blastocyste-embryons au stade ^10. Toutefois, étant donné que les blastocystes ont en moyenne 64 cellules (contenant 120-720 pg d'ADN génomique), cette méthode n'est pas efficace pour les études de méthylation sur les ovocytes individuels ou clivage au stade d'embryons.

tente "> Prendre des indices de plongement d'agarose des montants d'ADN minute, y compris les ovocytes ^11, nous présentons ici une méthode par laquelle les ovocytes sont directement intégrés dans une solution de lyse agarose et perles de récupération qui suit immédiatement et le retrait de la zone pellucide de l'ovocyte. Cela nous permet de contourner les deux principaux défis de la mutagenèse ovocyte unique: bisulfite. protégeant une infime quantité d'ADN de la dégradation et la perte subséquente au cours des étapes du protocole de nombreuses important, car les données sont obtenues à partir d'ovocytes simples, la question de la partialité PCR au sein des pools est éliminée plus. , par inadvertance la contamination de cellules du cumulus est détectable par cette méthode depuis n'importe quel échantillon avec plus d'un modèle de méthylation peuvent être exclus de l'analyse ^12. Ce protocole fournit une méthode améliorée pour les analyses réussies et reproductibles de méthylation de l'ADN au niveau unicellulaire et est parfaitement adapté des ovocytes individuels ainsi que le clivage au stade d'embryons.

Protocol

JOUR 1 Préparer les solutions suivantes fraîches sur le jour de la collecte des ovocytes avec l'eau distillée stérile comme l'eau GIBCO. Pour réduire le risque de contamination par l'ADN, changer de gants souvent et utiliser des embouts de filtre. Garder des tubes incliné à l'écart en position ouverte, et tous les tubes rappel lorsqu'il n'est pas utilisé. Nous recommandons que les solutions sont faites en n +1. 3% d'agarose LMP …

Discussion

Ce test seul ovocyte contient de nombreuses étapes avec un certain nombre qui sont essentiels et nécessitent des soins spéciaux. La première est le lavage des ovocytes. Il est particulièrement important de se laver chaque ovocyte à plusieurs reprises dans un milieu frais tombe suite à un traitement hyaluronidase pour enlever le plus les cellules du cumulus plus grand nombre possible. En outre, lors du transfert des ovocytes à la solution acide de Tyrode pour zone pellucide retrait assurez-vous du milieu environn…

Materials

Table of specific reagents and equipment.

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Oocyte Collection
Hyaluronidase	Sigma	H4272
Acidic Tyrode	Sigma	T1788
Proteinase K	Sigma	P5568
10% IGEPAL	Bioshop	NON999.500
Lysis Solution
Tris pH 7.5	Bioshop	TRS001.5
LiCl	Sigma	L9650
EDTA pH 8.0	Sigma	E5134
LiDS	Bioshop	LDS701.10
DTT	Invitrogen	P2325
SDS Lysis Buffer
TE pH 7.5	Bioshop(Tris) Sigma (EDTA)	TRS001.5 E5134
10% SDS	Bioshop	SDS001.500
Bisulfite Conversion
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite)	Sigma	243973
Hydroquinone	Sigma	H9003
Low Melting Point (LMP) Agarose	Sigma	A9414
Mineral Oil	Sigma	M8410
M2 Medium	Sigma	M7167
GIBCO Distilled water	Invitrogen	15230-196
Autoclaved double distilled (dd) water
PCR
Illustra Hot Start Mix RTG	GE Healthcare	28-9006-54
240 ng/ml yeast tRNA	Invitrogen	15401-011
5x Green GoTaq Reaction Buffer	Promega	M7911
Inner and outer nested primers	Sigma
Ligation
Promega pGEM-T Easy Vector	Fisher Scientific	A1360
TA Cloning
Competent E.coli cells	Zymo Research Corp.	T3009
Equipment
Dissecting Microscope
70°C and 90°C Heat Blocks
37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations)
Rocker
PCR machine