Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese
Summary
Bisulfit-Mutagenese ist der Goldstandard für die Analyse von DNA-Methylierung. Unsere modifizierte Protokoll ermöglicht DNA-Methylierungs-Analyse auf der Ebene einzelner Zellen und wurde speziell für die einzelnen Eizellen entwickelt. Es kann auch für die Spaltung-Embryonen verwendet werden.
Abstract
Epigenetik umfasst alle vererbbar und reversible Modifikationen an Chromatin, die alter-Gen Zugänglichkeit und damit die primären Mechanismen für die Regulierung der Gentranskription 1 sind. DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die überwiegend fungiert als repressiv-Marke. Durch die kovalente Addition einer Methylgruppe an Cytosin in CpG-Dinukleotide, kann es zu rekrutieren weitere Proteine und repressiven Histon-Modifikationen, um Prozesse in kondensierenden Chromatin und Abschaltung von Genen 2 beteiligt zu initiieren. DNA-Methylierung ist wichtig für die normale Entwicklung, da sie eine entscheidende Rolle in der Entwicklungsbiologie Programmierung, Zelldifferenzierung, Unterdrückung von retroviralen Elementen, X-Chromosom-Inaktivierung und genomische Prägung spielt.
Eine der mächtigsten Methoden zur DNA-Methylierungs-Analyse ist Bisulfit-Mutagenese. Natriumbisulfit ist ein DNA-Mutagen, die Cytosine desaminiert in Uracile. Nach PCR-Amplifikation und seque ncing werden diese Umwandlung Ereignisse wie Thymine erkannt. Methylierte Cytosine werden aus Desaminierung geschützt und damit als Cytosine bleiben, welche die Identifizierung von DNA-Methylierung bei der einzelne Nukleotid-Ebene 3. Die Entwicklung des Bisulfit-Mutagenese-Assay wurde von den ursprünglich gemeldeten 4-6 gegen diejenigen, die mehr sensitive und reproduzierbare 7 sind fortgeschritten. Ein wichtiger Fortschritt wurde Einbetten kleiner DNA-Mengen in einem Agarose-Kügelchen, wodurch Schutz der DNA vor der rauen Bisulfit-Behandlung 8. Damit konnte die Methylierungsanalyse auf Pools von Eizellen und Embryonen im Blastozysten-9 durchgeführt werden. Die anspruchsvollste Bisulfit-Mutagenese-Protokoll auf dem neuesten Stand ist für einzelne Blastozyste-Embryonen 10. Da jedoch Blastozysten im Durchschnitt 64 Zellen (mit einem Gehalt von 120 bis 720 pg genomischer DNA) haben, ist diese Methode nicht wirksam für die Methylierung Studien zu einzelnen Eizellen oder Embryonen-Spaltung.
Zelt "> Aufnehmen von Hinweisen aus Agarose Einbettung von Minuten DNA-Mengen einschließlich Oozyten 11, hier präsentieren wir eine Methode, bei der Eizellen direkt in einem Agarose-Lyse-Lösung und Wulst unmittelbar nach der Abruf und die Entfernung der Zona pellucida von der Eizelle eingebettet sind. Dies ermöglicht uns, Bypass die beiden wichtigsten Herausforderungen der einzigen Eizelle Bisulfit-Mutagenese:. Schutz einer winzigen Menge von DNA vor dem Abbau und anschließende Verlust während der zahlreichen Schritte Protokoll Wichtig ist, wie Daten aus einzelnen Eizellen gewonnen werden, die Frage der PCR-Bias-Pools innerhalb Außerdem entfällt. , unbeabsichtigte Kontamination Cumulus-Zellen nachweisbar ist, durch diese Methode, da jede Probe mit mehr als einem Methylierungsmuster von der Analyse ausgeschlossen werden kann 12. Dieses Protokoll bietet ein verbessertes Verfahren für eine erfolgreiche und reproduzierbare Analyse der DNA-Methylierung in der Ebene einzelner Zellen und ist ideal geeignet, für die einzelnen Eizellen sowie Embryonen-Spaltung.Protocol
Discussion
Diese einzelne Eizelle Assay enthält viele Schritte mit einer Zahl, die kritisch sind und bedürfen einer besonderen Pflege. Die erste ist Oozyte Waschen. Es ist besonders wichtig zu waschen Jeder Oocyt mehrmals in frischem Medium fällt nach Hyaluronidase-Behandlung, so viele Kumuluszellen wie möglich zu entfernen. Darüber hinaus bei der Übertragung von Eizellen, um saure Tyrode-Lösung für Zona pellucida Entfernung sicherstellen umgebenden Medium ist klar, von Cumulus-Zellen. Die Eizelle ist sehr klebrig zona nac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der University of Western Ontario, der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie unterstützt, und einen Zuschuss ER06-02-188 aus dem Ministryof Forschung und Innovation, Early Researcher Award. MMD wurde von einem CIHR-Trainings-Programm in der Reproduktion, frühe Entwicklung und die Auswirkungen auf die Gesundheit (REDIH) Graduate Scholarship unterstützt.
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
References
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