単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発
Summary
亜硫酸塩の突然変異誘発は、DNAメチル化を解析するためのゴールドスタンダードです。私たちの変更されたプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化解析を可能にし、特に個々の卵のために設計されました。また、開裂段階の胚に使用することができます。
Abstract
エピジェネティクスは、すべてがこのように遺伝子のアクセシビリティを変更し、遺伝子の転写1を調整するための主要なメカニズムであることをクロマチンに遺伝性で可逆的改変を包含する。 DNAメチル化は、抑圧的なマークとして主に作用するエピジェネティックな修飾である。 CpGジヌクレオチドのシトシン上のメチル基の共有結合的付加により、それは、クロマチンを凝縮と遺伝子2をサイレンシングに関与するプロセスを開始するために追加の抑圧的なタンパク質やヒストン修飾を募集することができます。それは発達のプログラミング、細胞分化、レトロエレメントの弾圧、X染色体不活性化とゲノムインプリンティングに重要な役割を果たしているDNAのメチル化は正常な発達に不可欠である。
DNAメチル化解析のための最も強力な方法の一つは、亜硫酸水素塩の突然変異誘発である。亜硫酸水素ナトリウムは、ウラシルにシトシンをdeaminates DNAの変異原である。 PCR増幅とseque以下 ncingは、これらの変換イベントはチミンとして検出されます。メチル化シトシンは脱アミノ化から保護するため、個々のヌクレオチドレベル3でDNAメチル化の同定を可能にする、シトシンのままにされています。亜硫酸塩の突然変異誘発アッセイの開発は、当初より高感度と7再現性のあるものに向かって4-6を報告されたものから発展してきた。一つの重要な進歩は、それによって過酷な重亜硫酸塩処理8からDNAを保護し、アガロースビーズにDNAの少量を埋め込 むされました。卵母細胞および胚盤胞段階の胚9のプール上で実行するために、この対応のメチル化解析。これまでで最も洗練された亜硫酸塩の突然変異誘発のプロトコルは、個々の胚盤胞段階の胚は10です。胚盤胞は、平均64個のセル（ゲノムDNAの120から720 pgを含む）を持っているのでしかし、この方法は、個々の卵母細胞または切断ステージ胚におけるメチル化研究のための効果的ではありません。
テント">卵母細胞11を含む分DNA量の埋め込 みをアガロースから手がかりをとると、ここでは卵母細胞を直接検索し、卵母細胞から透明帯を除去した後、直ちにアガロース溶解ソリューションビーズに埋め込 まれているさせる方法を提示します。これは私たちに可能単一の卵重亜硫酸突然変異誘発の2つの主要な課題を回避する：多数のプロトコルステップの間に低下し、その後の損失からのDNAの微量を保護する重要なことは、データが単一の卵母細胞から得られたとして、プール内のPCRバイアスの問題が排除されるさらに。複数のメチル化パターンを持つ任意のサンプルはこのプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化の成功と再現性の解析のための改良方法を提供する。分析12から除外されることがあり、理想的に適していますので、不注意な卵丘細胞の混入は、この方法で検出可能である個々の卵母細胞と同様に開裂段階の胚のために。Protocol
Discussion
この単一の卵母細胞アッセイは重要であり、特別なケアを必要とする数多くの手順が含まれています。最初は卵母細胞の洗浄です。それは、できるだけ多くの卵丘細胞のように削除するヒアルロニダーゼ処理後に廃棄し新鮮な培地に各卵母細胞を複数回洗浄することが特に重要である。また、透明帯を除去するため、酸性タイロード液に卵を転送するときは、周囲の媒体が卵丘細胞の明確で?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ウェスタン·オンタリオ、産科と婦人科の大学によってサポートされていました。とMinistryof研究とイノベーション、初期のリサーチャー賞からの助成金ER06-02-188。 MMDは、再生、早期開発と健康（REDIH）大学院奨学金への影響のCIHRのトレーニングプログラムによってサポートされていました。
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
References
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