Summary
Bisulfite mutagenese er gullstandarden for å analysere DNA metylering. Vår modifisert protokoll kan for DNA metylering analyse på encellet nivå og ble utviklet spesielt for enkelte oocytter. Den kan også brukes til kløv-trinns embryoer.
Abstract
Epigenetikk omfatter arvelig alle og reversible endringer i kromatin som alter genet tilgjengelighet, og dermed er de primære mekanismer for regulering gentranskripsjon en. DNA metylering er en epigenetisk modifikasjon som fungerer hovedsakelig som en undertrykkende mark. Gjennom kovalente tillegg av en metylgruppe på cytosines i CPG dinucleotides, kan det rekruttere flere undertrykkende proteiner og histonmodifikasjonene å initiere prosesser involvert i kondenserende kromatin og kutte gener to. DNA metylering er viktig for normal utvikling som den spiller en avgjørende rolle i utviklingsarbeid programmering, celledifferensiering, undertrykkelse av retrovirale elementer, X-kromosom inaktivering og genomisk imprinting.
En av de mest kraftfulle metoder for DNA metylering analyse er bisulfite mutagenese. Natrium bisulfite er en DNA mutagen som deaminates cytosines inn uracils. Etter PCR forsterkning og seque ncing er disse konverteringshendelser oppdaget som thymines. Denaturert cytosines er beskyttet mot deaminering og dermed forbli som cytosines, slik at identifisering av DNA metylering på individnivå nukleotid nivå 3. Utvikling av bisulfite mutagenese analysen har avansert fra dem som opprinnelig rapporterte 4-6 mot de som er mer sensitive og reproduserbare 7. Et sentralt avansement ble innebygging mindre mengder DNA i en agarose perle, og dermed beskytter DNA fra den harde bisulfite behandling 8. Dette aktivert metylering analysen skal utføres på bassenger av ubefruktede egg og blastocyst-stadium embryoer 9. Den mest sofistikerte bisulfite mutagenese protokollen til dags dato er for individuelle blastocyst-stadium embryoer 10. Men siden blastocysts har i gjennomsnitt 64 celler (inneholder 120-720 pg av genomisk DNA), er denne metoden ikke virkningsfulle for metylering studier på enkelte oocytter eller spalting-trinns embryoer.
telt "> Tar ledetråder fra agarose innebygging av liten DNA beløp inkludert oocytter 11, her presenterer vi en metode der ubefruktede egg er direkte innebygd i en agarose og lysis løsning perle umiddelbart etter henting og fjerning av zona pellucida fra oocyte. Dette gjør oss til omgå de to hovedutfordringer enkelt oocyte bisulfite mutagenese:. beskytter en liten mengde DNA fra degradering og påfølgende tap i løpet av de tallrike protokollen trinnene Viktigere, som hentes fra enkeltrom eggceller, er spørsmålet om PCR skjevhet i bassengene eliminert Videre. , utilsiktet Cumulus celle forurensning kan påvises ved denne metoden siden enhver prøve med mer enn en metylering mønster kan utelukkes fra analysen 12. Denne protokollen gir en forbedret metode for vellykkede og reproduserbare analyser av DNA metylering ved encellet nivå og er ideell for individuelle oocytter samt cleavage-trinns embryoer.Protocol
Discussion
Denne singelen oocyte analysen inneholder mange skritt med et nummer som er kritiske og krever spesiell omsorg. Den første er oocyte vask. Det er spesielt viktig å vaske hver eggcelle flere ganger i frisk medium synker etter Hyaluronidase behandling for å fjerne så mange cumulus celler som mulig. Videre, ved overføring oocytter til sure tyrode løsning for zona pellucida fjerning sørge omgivende mediet er klar over cumulus celler. Den oocyte er veldig klissete etter Zona fjerning, og eventuelle omkringliggende cum…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av University of Western Ontario, Institutt for obstetrikk og gynekologi, og en bevilgning ER06-02-188 fra Ministryof forskning og innovasjon, Early Forsker Award. MMD ble støttet av en CIHR Training Program i Reproduksjon, Tidlig utvikling og påvirkningen på helse (REDIH) Graduate Scholarship.
Materials
Table of specific reagents and equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Oocyte Collection | |||
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | |
| Acidic Tyrode | Sigma | T1788 | |
| Proteinase K | Sigma | P5568 | |
| 10% IGEPAL | Bioshop | NON999.500 | |
| Lysis Solution | |||
| Tris pH 7.5 | Bioshop | TRS001.5 | |
| LiCl | Sigma | L9650 | |
| EDTA pH 8.0 | Sigma | E5134 | |
| LiDS | Bioshop | LDS701.10 | |
| DTT | Invitrogen | P2325 | |
| SDS Lysis Buffer | |||
| TE pH 7.5 |
Bioshop(Tris) Sigma (EDTA) |
TRS001.5 E5134 |
|
| 10% SDS | Bioshop | SDS001.500 | |
| Bisulfite Conversion | |||
| Sodium Hydroxide | Sigma | S8045 | |
| Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite) | Sigma | 243973 | |
| Hydroquinone | Sigma | H9003 | |
| Low Melting Point (LMP) Agarose | Sigma | A9414 | |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | |
| M2 Medium | Sigma | M7167 | |
| GIBCO Distilled water | Invitrogen | 15230-196 | |
| Autoclaved double distilled (dd) water | |||
| PCR | |||
| Illustra Hot Start Mix RTG | GE Healthcare | 28-9006-54 | |
| 240 ng/ml yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
| 5x Green GoTaq Reaction Buffer | Promega | M7911 | |
| Inner and outer nested primers | Sigma | ||
| Ligation | |||
| Promega pGEM-T Easy Vector | Fisher Scientific | A1360 | |
| TA Cloning | |||
| Competent E.coli cells | Zymo Research Corp. | T3009 | |
| Equipment | |||
| Dissecting Microscope | |||
| 70°C and 90°C Heat Blocks | |||
| 37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations) | |||
| Rocker | |||
| PCR machine | |||
References
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
- Rodenhiser, D., Mann, M. Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. CMAJ. 174, 341-348 (2006).
- Frommer, M. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1827-1831 (1992).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Feil, R., Charlton, J., Bird, A. P., Walter, J., Reik, W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 22, 695-696 (1994).
- Raizis, A. M., Schmitt, F., Jost, J. P. A bisulfite method of 5-methylcytosine mapping that minimizes template degradation. Anal. Biochem. 226, 161-166 (1995).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis. J. Vis. Exp. (56), e3170 (2011).
- Olek, A., Oswald, J., Walter, J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 24, 5064-5066 (1996).
- Mann, M. R. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131, 3727-3735 (2004).
- Market-Velker, B. A., Zhang, L., Magri, L. S., Bonvissuto, A. C., Mann, M. R. Dual effects of superovulation: loss of maternal and paternal imprinted methylation in a dose-dependent manner. Hum. Mol. Genet. 19, 36-51 (2010).
- Meng, L. H., Xiao, S. Q., Huang, X. F., Zhou, Y., Xu, B. S. A study on bisulfite sequencing method for methylation status of imprinted genes in single human oocytes. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 25, 289-292 (2008).
- Denomme, M. M., Zhang, L., Mann, M. R. Embryonic imprinting perturbations do not originate from superovulation-induced defects in DNA methylation acquisition. Fertil. Steril. 96, 734-738 (2011).
- Tahiliani, M. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324, 930-935 (2009).
- Hajj, N. E. l. Limiting dilution bisulfite (pyro)sequencing reveals parent-specific methylation patterns in single early mouse embryos and bovine oocytes. Epigenetics. 6, 1176-1188 (2011).
