Único ovocito Mutagénesis bisulfito

Summary

Bisulfito de mutagénesis es el estándar de oro para el análisis de la metilación del ADN. Nuestro protocolo modificado permite el análisis de metilación del ADN en el ámbito de una sola célula y fue diseñado específicamente para los ovocitos individuales. También se puede utilizar para los embriones etapa de escisión.

Abstract

La epigenética abarca todos hereditarias y las modificaciones reversibles a la cromatina que la accesibilidad alter gen, y por lo tanto son los principales mecanismos para la regulación de la transcripción de genes ^1. Metilación del ADN es una modificación epigenética que actúa sobre todo como una marca represivo. A través de la adición covalente de un grupo metilo a las citosinas en dinucleótidos CpG, se puede contratar a otras proteínas de represión y modificaciones de las histonas para iniciar procesos involucrados en la condensación de la cromatina y el silenciamiento de genes ^2. Metilación del ADN es esencial para el desarrollo normal, ya que desempeña un papel fundamental en la programación del desarrollo, la diferenciación celular, la represión de elementos retrovirales, la inactivación del cromosoma X y la impronta genómica.

Uno de los métodos más poderosos para el análisis de la metilación del ADN es la mutagénesis bisulfito. Bisulfito de sodio es un mutágeno ADN que desamina citosinas en uracilos. Tras la amplificación por PCR y Seque ncing, estos eventos de conversión se detectan como timinas. Citosinas metiladas están protegidos de la desaminación y por lo tanto permanecen como citosinas, que permita la identificación de la metilación del ADN en el nivel individual de nucleótidos ^3. Desarrollo del ensayo mutagénesis bisulfito ha avanzado de las originalmente presentadas ^4-6 hacia los que son más sensibles y reproducibles ^7. Un avance clave fue incrustar pequeñas cantidades de ADN en un cordón de agarosa, protegiendo así el ADN del tratamiento bisulfito dura ^8. Este análisis de metilación habilitado para llevar a cabo en las piscinas de los ovocitos y blastocitos, embriones de ^9. El protocolo de mutagénesis bisulfito de los más sofisticados hasta la fecha es de cada etapa de blastocisto, embriones de ^10. Sin embargo, puesto que los blastocistos tienen un promedio de 64 células (que contiene 120-720 pg de ADN genómico), este método no es eficaz para los estudios de metilación en oocitos individuales o embriones etapa de escisión.

tienda "> Tomando pistas de la incrustación de agarosa de las cantidades de ADN minutos incluyendo ¹¹ ovocitos, aquí se presenta un método por el cual los ovocitos están directamente incrustado en una solución de agarosa y lisis cordón de recuperación inmediatamente después y la eliminación de la zona pelúcida del ovocito. Esto nos permite pasar por alto los dos principales retos de la mutagénesis sola bisulfito de ovocitos:. la protección de una pequeña cantidad de ADN de la degradación y la pérdida subsecuente durante los pasos del protocolo numerosos importante, ya que los datos se obtienen a partir de ovocitos individuales, el problema del sesgo de PCR en las piscinas se elimina otra. , contaminación inadvertida célula cúmulo es detectable por este método, puesto que cualquier muestra con patrón de metilación más de un pueden ser excluidos de análisis ^12. Este protocolo proporciona un método mejorado para el análisis de éxito y reproducible de la metilación del ADN en el nivel de una sola célula y se adapta idealmente de oocitos individuales, así como embriones en estado de división.

Protocol

DIA 1 Prepare las siguientes soluciones frescas en el día de la recogida de ovocitos con agua destilada estéril, como el agua GIBCO. Para reducir el riesgo de contaminación de ADN, cambiar los guantes con frecuencia y utilizar puntas con filtro. Mantener tubos ángulo lejos cuando está abierto, y recapitular todos los tubos cuando no esté en uso. Se recomienda que las soluciones se hacen como n +1. 3% de agarosa LMP Punto 30 mg de fusi…

Discussion

Este ensayo contiene un solo ovocito muchos pasos con un número que son críticas y requieren un cuidado especial. El primero es el lavado de los ovocitos. Es particularmente importante para lavar cada oocito varias veces en medio fresco cae después del tratamiento hialuronidasa para eliminar las células cumulus como sea posible. Por otra parte, cuando la transferencia de ovocitos a la solución ácida de Tyrode para la zona pelúcida asegurarse de la eliminación medio circundante está libre de células del cumulus…

Materials

Table of specific reagents and equipment.

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Oocyte Collection
Hyaluronidase	Sigma	H4272
Acidic Tyrode	Sigma	T1788
Proteinase K	Sigma	P5568
10% IGEPAL	Bioshop	NON999.500
Lysis Solution
Tris pH 7.5	Bioshop	TRS001.5
LiCl	Sigma	L9650
EDTA pH 8.0	Sigma	E5134
LiDS	Bioshop	LDS701.10
DTT	Invitrogen	P2325
SDS Lysis Buffer
TE pH 7.5	Bioshop(Tris) Sigma (EDTA)	TRS001.5 E5134
10% SDS	Bioshop	SDS001.500
Bisulfite Conversion
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045
Sodium Hydrogensulfite (Sodium Bisulfite)	Sigma	243973
Hydroquinone	Sigma	H9003
Low Melting Point (LMP) Agarose	Sigma	A9414
Mineral Oil	Sigma	M8410
M2 Medium	Sigma	M7167
GIBCO Distilled water	Invitrogen	15230-196
Autoclaved double distilled (dd) water
PCR
Illustra Hot Start Mix RTG	GE Healthcare	28-9006-54
240 ng/ml yeast tRNA	Invitrogen	15401-011
5x Green GoTaq Reaction Buffer	Promega	M7911
Inner and outer nested primers	Sigma
Ligation
Promega pGEM-T Easy Vector	Fisher Scientific	A1360
TA Cloning
Competent E.coli cells	Zymo Research Corp.	T3009
Equipment
Dissecting Microscope
70°C and 90°C Heat Blocks
37°C and 50°C Waterbaths (42°C for transformations)
Rocker
PCR machine