성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상
Summary
우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 – 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.
Abstract
새로운 기능 뉴런이 constitutively 성인 포유류의 뇌의 제한된 영역에서 신경 줄기 세포의 내생 풀에서 생성을 나타내는 증거의 상당한 몸이있다. subventricular 영역 (SVZ)에서 신생아 neuroblasts는 후각 망울 (OB) 1에서의 최종 목적지까지의 뱃 부리 장식이있는 철새 스트림 (RMS)을 함께 마이그레이션. RMS에서 neuroblasts은 구조 지원 및 마이그레이션 4,5에 필요한 분자 요소의 소스로 혈관을 사용하여 astrocytic 프로세스 2,3에 의해 ensheathed 체인에 tangentially 마이그레이션. OB에서 neuroblasts는 체인에서 분리하고 interneurons로 차별화하고 기존의 네트워크 1, 6에 통합 다른 안구 레이어로 방사상으로 마이그레이션됩니다.
이 원고에서 우리는 쥐의 뇌의 급성 조각의 모니터링 셀 마이그레이션에 대한 절차를 설명합니다. 급성 조각의 사용은 assessm 수 있습니다밀접하게 생체 조건과 생체 이미징에 대해 액세스하기 어렵 뇌 영역에서에 유사한하는 microenvironment의 세포 마이그레이션 다닐. 또한, 결국 세포의 이주 속성을 변경할 수도 있습니다 organotypic과 셀 문화의 경우에서와 같이 긴 배양 조건을 방지합니다. 급성 조각의 Neuronal 전구체는 DIC 광학 또는 형광 단백질을 사용하여 시각화 할 수 있습니다. 야생 형 생쥐의 SVZ에 기자 마우스에서 neuroblasts을 접목하고, neuroblasts에 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 쥐를 사용하여 SVZ의 neuronal 전구체의 바이러스 성 라벨은 neuroblasts을 표시하고 이전에 따라에 대한 모든 적합한 방법입니다. 나중에 방법은 그러나, 개별 셀 때문에 분류 세포의 높은 밀도의 장기간 추적 할 수 없습니다. 우리는 비교적 빠른 수집 간격 (한 IMA 달성하기 위해 CCD 카메라가 장착 된 넓은 분야 형광 수직 현미경을 사용GE 매 15 또는 30 초)가 안정적으로 고정와 철새 단계를 식별합니다. 고정와 철새 단계 기간의 정확한 식별 결과의 모호 해석에 매우 중요합니다. 우리는 또한 3D로 neuroblasts 마이그레이션을 모니터링하기 위해 여러 Z 단계 인수를 수행. 폭 넓은 분야 형광 이미징은 neuronal 마이그레이션에게 7-10를 시각적으로 광범위하게 사용되어왔다. 여기, 우리는 neuroblasts 라벨을 성인 마우스 forebrain의 급성 조각에 neuroblast 이주의 실시간 비디오 영상을 수행하고, 세포 마이그레이션을 분석에 대한 자세한 절차를 설명합니다. 설명 프로토콜 성인 RMS의 neuroblasts의 마이그레이션을 예시 있지만, 또한 배아 및 조기 출생 후의 두뇌에 세포 이주를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Discussion
적절한 뇌 지역에 neuronal 전구체의 올바른 타겟팅은 신경 회로의 적절한 조립과 기능의 근간이 기본 과정입니다. 세포의 대부분은 배아 발달 동안 마이그레이션 만 등의 OB, 이가있는 이랑과 소뇌 등의 몇 지역에서 출생 후의 두뇌에 neuronal 변위는 아직 이루어집니다. 출생 후의 뇌의 세포 마이그레이션을 꾸미고 메커니즘이 저조한 이해하지만, 남아 있습니다. 성숙한 신경 조직에 세포 마이그…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 Université 라발의 교제에 의해 지원되었다 ASJK에 건강 연구 (CIHR) 교부금의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. AS 출생 후의 neurogenesis에 캐나다 연구 의자의 수신자입니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
| NaCI | Sigma | S9625 |
| KCI | Sigma | P9541 |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| HBSS | Gibco | 14170-112 |
| DNase I | Sigma | D-5025 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| BSA | EMD | 2930 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
| Suture | Stoelting | 50487 |
| Anafen | CDMV | 11508 |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
| Petri dish | VWR | 25384-094 |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
| Glue | Permabond | 910 |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
| Blade | WPI | 501901 |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
| Micro drill system | WPI | 501819 |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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