成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の移行のタイムラプスイメージング
Summary
我々は、マウスの前脳におけるニューロン移動のリアルタイムvideoimagingためのプロトコルを記述します。ウイルス標識又はグラフト神経前駆細胞の遊走は、固定と移動相の持続時間と速度を含む細胞遊走のさまざまなフェーズを、勉強するのは比較的急速な取得間隔と広視野蛍光イメージングを用いた急性スライスのライブで録音された移行。
Abstract
新しい機能性ニューロンが恒常的に成体哺乳類の脳の制限区域内の神経幹細胞の内因性のプールから生成されていることを示す証拠の実質的なボディがあります。脳室下帯（SVZ）から新生児神経芽細胞は、嗅球（OB）が1で、最終的な宛先に吻側渡り鳥ストリーム（RMS）に沿って移行します。 RMSで、神経芽細胞は、構造的な支持と移行4,5に必要な分子因子の供給源としての血管を使用して星状膠細胞の突起2,3によってensheathedチェーンで接線方向に移行します。 OBで、神経芽細胞はチェーンから切り離し、それらは介在ニューロンに分化し、既存のネットワーク1、6に統合異なる球層に放射状に移行します。
本稿では、我々は齧歯類の脳の急性スライスにおける細胞移動を監視するための手順を説明します。急性スライスの使用はassessmを許可密接にインビボ条件および in vivoイメージングにアクセスが困難な脳領域でに似ているという微小環境における細胞移動のENT。さらに、それは最終的に細胞の遊走特性を変化させることができる器官および細胞培養の場合のように、長い培養状態を回避できます。急性スライスにおける神経前駆細胞は、DIC光学または蛍光タンパク質を用いて可視化することができます。野生型マウスのSVZにレポーターマウスから神経芽細胞を移植し、神経芽細胞に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いてSVZにおける神経前駆細胞のウイルスラベリングは、神経芽細胞を可視化し、それらの移動を追跡するためのすべての適当な方法である。後者の方法は、しかし、個々の細胞が原因で標識された細胞の高密度の長時間追跡することはできません。我々は、比較的急速な取得間隔（1つのIMAを達成するためにCCDカメラを搭載した広視野の蛍光正立顕微鏡を使用確実に静止して渡り鳥のフェーズを識別するために、GEごとに15または30秒）。静止および移動相の持続時間の正確な同定結果の明確な解釈のために重要である。我々はまた、3Dでの神経芽細胞の移行を監視するために複数のzステップの買収を行いました。広視野の蛍光イメージングは、ニューロンの移動7-10を視覚化するために広く使用されています。ここで、我々は、神経芽細胞を標識成体マウスの前脳の急性スライスにおける神経芽細胞の遊走をリアルタイムにビデオ撮影を行うと、細胞遊走を分析するための詳細なプロトコルを記述します。説明されたプロトコルは成人RMSでの神経芽細胞の遊走を例示したが、それは、胚や初期生後脳における細胞移動を追跡するために使用することができます。
Protocol
Discussion
適切な脳領域に神経前駆細胞の正確なターゲティングは、神経回路の適切なアセンブリと関数の基礎となる基本的なプロセスです。細胞の大半は、胚発生中に移行し、唯一のそのようなOB、歯状回および小脳などのいくつかの地域では、出生後の脳では、ニューロンの変位は、まだ行われます。出生後の脳内の細胞遊走を編成するメカニズムはよくわかっていない、しかし、残っている?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、部分的にラヴァル大学の交わりによってサポートされていましたASJKに健康研究（CIHR）助成金のカナダの協会によってサポートされていました。 ASは出生後の神経発生におけるカナダリサーチチェアの受取人である。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
| NaCI | Sigma | S9625 |
| KCI | Sigma | P9541 |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| HBSS | Gibco | 14170-112 |
| DNase I | Sigma | D-5025 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| BSA | EMD | 2930 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
| Suture | Stoelting | 50487 |
| Anafen | CDMV | 11508 |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
| Petri dish | VWR | 25384-094 |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
| Glue | Permabond | 910 |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
| Blade | WPI | 501901 |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
| Micro drill system | WPI | 501819 |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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