Vi beskriver en protokol for real-time videoimaging af neuronal migration i mus forhjerne. Migrationen af viralt mærkede eller podes neuronale forstadier blev indspillet i akutte levende udsnit med bred felt fluorescerende billeddannelse med en relativt hurtig overtagelse interval for at studere de forskellige faser af cellemigration, herunder varigheden af den stationære og overgangsfaser og hastigheden af migration.
Der er en betydelig mængde af beviser tyder på, at nye funktionelle neuroner konstitutivt genereres fra en endogen pulje af neurale stamceller i begrænsede områder af den voksne pattedyrs hjerne. Nyfødte neuroblaster fra subventricular zone (SVZ) vandrer langs rostral vandrende strøm (RMS) til deres endelige bestemmelsessted i lugtekolben (OB) 1. I RMS, migrere neuroblaster tangentialt i lænker ensheathed af astrocytiske processer 2,3 ved hjælp af blodkar som en strukturel støtte og en kilde til molekylære faktorer, der er nødvendige for migration 4,5. I OB, frigøre neuroblaster fra kæderne og migrere radialt ind i de forskellige bulbære lag, hvor de differentierer til interneuroner og integreres i det eksisterende net 1, 6.
I dette manuskript vi beskrive proceduren for overvågning af cellemigration i akutte skiver af gnaver hjernen. Anvendelsen af akutte skiver tillader assessment af cellemigrering i mikromiljøet, der nøje ligner til in vivo betingelser og i de områder af hjernen, der er vanskelige at få adgang til in vivo billeddannelse. Derudover undgår det lange dyrkning tilstand som i tilfælde af organotypiske og cellekulturer, der måtte ændre de migrationsegenskaber i cellerne. Neuronale prækursorer i akutte skiver kan visualiseres under anvendelse af DIC optik eller fluorescerende proteiner. Viral mærkning af neuronale prækursorer i SVZ, podning neuroblaster fra reporter-mus i SVZ af vildtype-mus, og anvendelse af transgene mus, der udtrykker fluorescerende protein i neuroblaster er alle egnede fremgangsmåder til visualisering af neuroblaster og efter deres vandring. Den senere metode er imidlertid ikke tillader individuelle celler, der skal spores i lange perioder på grund af den høje tæthed af mærkede celler. Vi anvendte en bred felt fluorescerende opretstående mikroskop udstyret med et CCD-kamera til at opnå en relativt hurtig opsamling interval (en image hver 15 eller 30 sekunder) til pålideligt identificere den stationære og vandrende faser. En præcis identifikation af varigheden af den stationære og vandrende faser er afgørende for entydig fortolkning af resultaterne. Vi har også foretaget flere z-trinvise overtagelser at overvåge neuroblaster migration i 3D. Wide-field fluorescerende billeddannelse har været brugt i udstrakt grad at visualisere neuronal migration 7-10. Her beskriver vi detaljeret protokol til mærkning neuroblaster, der udfører real-time video-imaging af neuroblast migration i akutte skiver af den voksne mus forhjerne, og analysere celle migration. Mens den beskrevne protokol eksemplificeret migrationen af neuroblaster i den voksne RMS, kan den også anvendes til at følge cellemigrering i embryoniske og tidlige postnatale hjerner.
Den korrekte målretning af neuronale prækursorer til de passende områder af hjernen er en grundlæggende proces ligger til grund for korrekt samling og funktion af neurale kredsløb. Langt størstedelen af celler migrerer under embryonisk udvikling og i den postnatale hjerne kun i nogle få regioner, såsom OB, gyrus dentatus og cerebellum, stadig neuronal forskydning finder sted. De mekanismer orkestrere cellemigrering i den postnatale hjerne dog fortsat dårligt forstået. Kendskab til de mekanismer og moleky…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en canadisk Institutes of Health Research (CIHR) tilskud til ASJK blev delvis støttet af en Université Laval fællesskab. AS er modtageren af en Canada Research Chair i postnatal neurogenese.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sucrose | Sigma | S9378 |
Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
NaCI | Sigma | S9625 |
KCI | Sigma | P9541 |
MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
HEPES | Sigma | H3375 |
HBSS | Gibco | 14170-112 |
DNase I | Sigma | D-5025 |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
BSA | EMD | 2930 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
Suture | Stoelting | 50487 |
Anafen | CDMV | 11508 |
20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
Petri dish | VWR | 25384-094 |
Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
Glue | Permabond | 910 |
95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
Blade | WPI | 501901 |
Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
Micro drill system | WPI | 501819 |
Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |