Time-lapse Imaging af neuroblast Migration i Akutte Skiver af den voksne Mouse forhjerne
Summary
Vi beskriver en protokol for real-time videoimaging af neuronal migration i mus forhjerne. Migrationen af viralt mærkede eller podes neuronale forstadier blev indspillet i akutte levende udsnit med bred felt fluorescerende billeddannelse med en relativt hurtig overtagelse interval for at studere de forskellige faser af cellemigration, herunder varigheden af den stationære og overgangsfaser og hastigheden af migration.
Abstract
Der er en betydelig mængde af beviser tyder på, at nye funktionelle neuroner konstitutivt genereres fra en endogen pulje af neurale stamceller i begrænsede områder af den voksne pattedyrs hjerne. Nyfødte neuroblaster fra subventricular zone (SVZ) vandrer langs rostral vandrende strøm (RMS) til deres endelige bestemmelsessted i lugtekolben (OB) 1. I RMS, migrere neuroblaster tangentialt i lænker ensheathed af astrocytiske processer 2,3 ved hjælp af blodkar som en strukturel støtte og en kilde til molekylære faktorer, der er nødvendige for migration 4,5. I OB, frigøre neuroblaster fra kæderne og migrere radialt ind i de forskellige bulbære lag, hvor de differentierer til interneuroner og integreres i det eksisterende net 1, 6.
I dette manuskript vi beskrive proceduren for overvågning af cellemigration i akutte skiver af gnaver hjernen. Anvendelsen af akutte skiver tillader assessment af cellemigrering i mikromiljøet, der nøje ligner til in vivo betingelser og i de områder af hjernen, der er vanskelige at få adgang til in vivo billeddannelse. Derudover undgår det lange dyrkning tilstand som i tilfælde af organotypiske og cellekulturer, der måtte ændre de migrationsegenskaber i cellerne. Neuronale prækursorer i akutte skiver kan visualiseres under anvendelse af DIC optik eller fluorescerende proteiner. Viral mærkning af neuronale prækursorer i SVZ, podning neuroblaster fra reporter-mus i SVZ af vildtype-mus, og anvendelse af transgene mus, der udtrykker fluorescerende protein i neuroblaster er alle egnede fremgangsmåder til visualisering af neuroblaster og efter deres vandring. Den senere metode er imidlertid ikke tillader individuelle celler, der skal spores i lange perioder på grund af den høje tæthed af mærkede celler. Vi anvendte en bred felt fluorescerende opretstående mikroskop udstyret med et CCD-kamera til at opnå en relativt hurtig opsamling interval (en image hver 15 eller 30 sekunder) til pålideligt identificere den stationære og vandrende faser. En præcis identifikation af varigheden af den stationære og vandrende faser er afgørende for entydig fortolkning af resultaterne. Vi har også foretaget flere z-trinvise overtagelser at overvåge neuroblaster migration i 3D. Wide-field fluorescerende billeddannelse har været brugt i udstrakt grad at visualisere neuronal migration 7-10. Her beskriver vi detaljeret protokol til mærkning neuroblaster, der udfører real-time video-imaging af neuroblast migration i akutte skiver af den voksne mus forhjerne, og analysere celle migration. Mens den beskrevne protokol eksemplificeret migrationen af neuroblaster i den voksne RMS, kan den også anvendes til at følge cellemigrering i embryoniske og tidlige postnatale hjerner.
Protocol
Discussion
Den korrekte målretning af neuronale prækursorer til de passende områder af hjernen er en grundlæggende proces ligger til grund for korrekt samling og funktion af neurale kredsløb. Langt størstedelen af celler migrerer under embryonisk udvikling og i den postnatale hjerne kun i nogle få regioner, såsom OB, gyrus dentatus og cerebellum, stadig neuronal forskydning finder sted. De mekanismer orkestrere cellemigrering i den postnatale hjerne dog fortsat dårligt forstået. Kendskab til de mekanismer og moleky…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en canadisk Institutes of Health Research (CIHR) tilskud til ASJK blev delvis støttet af en Université Laval fællesskab. AS er modtageren af en Canada Research Chair i postnatal neurogenese.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
| NaCI | Sigma | S9625 |
| KCI | Sigma | P9541 |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| HBSS | Gibco | 14170-112 |
| DNase I | Sigma | D-5025 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| BSA | EMD | 2930 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
| Suture | Stoelting | 50487 |
| Anafen | CDMV | 11508 |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
| Petri dish | VWR | 25384-094 |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
| Glue | Permabond | 910 |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
| Blade | WPI | 501901 |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
| Micro drill system | WPI | 501819 |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
