Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für Echtzeit videoimaging neuronaler Migration im Vorderhirn Maus. Die Migration von viral etikettiert oder aufgepfropft wurde neuronalen Vorläuferzellen in akuten Live Scheiben unter Verwendung Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung mit einer relativ schnellen Erfassungsintervall, um die unterschiedlichen Phasen der Zellmigration, einschließlich der Dauer der stationären und Migration Phasen und der Geschwindigkeit aufgezeichnet studieren Migration.
Abstract
Es gibt eine beträchtliche Anzahl von Beweisen dafür, dass neue funktionelle Neuronen konstitutiv sind von einem endogenen Pool von neuralen Stammzellen in eingeschränkten Bereichen der erwachsenen Gehirn von Säugetieren erzeugt. Newborn Neuroblasten aus der subventrikulären Zone (SVZ) wandern entlang des rostralen Migrationsstrom (RMS) an ihren endgültigen Bestimmungsort im Riechkolben (OB) 1. In der RMS, Neuroblasten tangential migrieren in Ketten von 2,3 Astrozytenfortsätze Verwendung Blutgefäße als strukturelle Unterstützung und eine Quelle für molekularen Faktoren für die Migration 4,5 erforderlich umhüllt. In der OB, Neuroblasten von den Ketten lösen sich und wandern radial in den verschiedenen bulbären Lagen, wo sie differenzieren sich in Interneuronen und Integration in das bestehende Netzwerk 1, 6.
In diesem Manuskript beschreiben wir das Verfahren für die Überwachung der Zellwanderung in akuten Schnitten des Nagergehirn. Die Verwendung von akuten Scheiben ermöglicht die assessment der Zellwanderung in der Mikroumgebung, dass sehr ähnlich in vivo Bedingungen und in Hirnregionen, die schwer zu in-vivo-Bildgebung zugänglich sind. Darüber hinaus vermeidet es lange Kultivierung Bedingung wie im Fall von organotypischen und Zellkulturen, die schließlich verändern kann die Migrations-Eigenschaften der Zellen. Neuronalen Vorläuferzellen in akuten Scheiben können visualisiert werden unter Verwendung von DIC Optik oder fluoreszierende Proteine. Virale Etikettierung von neuronalen Vorläufern in dem SVZ, Pfropfung Neuroblasten aus Reporter-Mäuse in der SVZ von Wildtyp-Mäusen, und unter Verwendung von transgenen Mäusen, die fluoreszierende Protein exprimieren in Neuroblasten sind alle geeignete Methoden zur Visualisierung Neuroblasten und nach ihrer Migration. Die spätere Verfahren ist jedoch nicht möglich einzelne Zellen über lange Zeiträume aufgrund der hohen Dichte von markierter Zellen verfolgt werden. Wir verwendeten eine Weitfeld-fluoreszierenden aufrechtes Mikroskop mit einer CCD-Kamera ausgestattet ist, um eine relativ schnelle Erfassungsintervall (eine ima erreichenge alle 15 oder 30 Sek.), um sicher zu identifizieren die stationäre und wandernde Phasen. Eine genaue Identifizierung der Dauer der stationären und wandernden Phasen ist entscheidend für die eindeutige Interpretation der Ergebnisse. Wir führten auch mehrere z-Schritt Akquisitionen Neuroblasten Migration in 3D zu überwachen. Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung wurde ausgiebig zu visualisieren neuronalen Migration 7-10 verwendet. Hier beschreiben wir detailliertes Protokoll zur Beschriftung Neuroblasten, Durchführung Echtzeit-Video-Bildgebung Neuroblast Migration in akuten Schnitten des adulten Maus Vorderhirn und Analyse Zellmigration. Während die beschriebene Protokoll die Migration von Neuroblasten im adulten RMS veranschaulicht, kann es auch verwendet werden, um die Zellmigration in embryonalen und frühen postnatalen Gehirn folgen.
Protocol
Discussion
Die korrekte Ausrichtung der neuronalen Vorläuferzellen zu den entsprechenden Hirnregionen ist ein fundamentaler Prozess zugrunde liegende ordnungsgemäße Montage und Funktion neuronaler Schaltkreise. Die überwiegende Mehrheit der Zellen während der Embryonalentwicklung wandern und in der postnatalen Gehirn nur in wenigen Regionen, wie der OB, Gyrus dentatus und Kleinhirn, neuronale Verschiebung noch stattfindet. Die Mechanismen orchestrieren Zellwanderung in der postnatalen Gehirn verbleiben jedoch nur unzureichend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) Zuschuss zu ASJK wurde teilweise durch einen Université Laval Gemeinschaft unterstützt werden. AS ist der Empfänger einer Canada Research Chair in postnatale Neurogenese.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
| NaCI | Sigma | S9625 |
| KCI | Sigma | P9541 |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| HBSS | Gibco | 14170-112 |
| DNase I | Sigma | D-5025 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| BSA | EMD | 2930 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
| Suture | Stoelting | 50487 |
| Anafen | CDMV | 11508 |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
| Petri dish | VWR | 25384-094 |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
| Glue | Permabond | 910 |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
| Blade | WPI | 501901 |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
| Micro drill system | WPI | 501819 |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
References
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