Voorbereiding van Acute subventriculaire zone Schijfjes voor Calcium Imaging
Summary
Werkwijze voor subventriculaire zone (SVZ) cellen geladen met calcium indicator kleurstoffen voor opname calcium activiteit beschreven. De postnatale SVZ bevat dicht opeengepakte cellen met inbegrip van neurale progenitor cellen en neuroblasten. Plaats van bad loading injecteerden we de kleurstof door druk in het weefsel voor een beter kleurstofdiffusieoverdracht.
Abstract
De subventriculaire zone (SVZ) is een van de twee neurogene zones in de postnatale hersenen. De SVZ bevat dicht op elkaar gepakte cellen, met inbegrip van neurale progenitorcellen met astrocytaire functies (de zogenaamde SVZ astrocyten), neuroblasten, en tussenliggende progenitorcellen. Neuroblasten geboren in de SVZ tangentiaal migreren een grote afstand tot de bulbus olfactorius, waar ze differentiëren tot interneuronen. Intercellulaire signalering door middel van adhesiemoleculen en diffundeerbare signalen spelen een belangrijke rol bij het beheersen van neurogenese. Veel van deze signalen te activeren intercellulaire calcium activiteit die informatie binnen en tussen cellen verzendt. Calcium activiteit is dus representatief voor de activiteit van extracellulaire signalen en is optimaal aan functionele intercellulaire signalering tussen SVZ cellen te begrijpen.
Calcium activiteit is bestudeerd in veel andere gebieden en celtypen, waaronder rijpe astrocyten en neuronen. De traditionele methode load cellen met calcium indicator kleurstof (dwz bad laden) was niet efficiënt bij het laden alle SVZ celtypen. Inderdaad, de celdichtheid in de SVZ sluit kleurstofdiffusie in het weefsel. Bovendien zal bereiden sagittale plakken beter behoud van de driedimensionale schikking van SVZ cellen, met name de stroom neuroblast migratie de rostrale-caudale as.
Hier beschrijven we methoden om sagittale secties waarin de SVZ, het laden van SVZ cellen met calcium indicator kleurstof, en de overname van calcium activiteit met time-lapse filmpjes te bereiden. We gebruikten Fluo-4 AM kleurstof voor het laden van SVZ astrocyten met behulp van druk toepassing binnen het weefsel. Calcium activiteit werd opgenomen met behulp van een scanning confocale microscoop zodat een nauwkeurige resolutie voor het onderscheiden van afzonderlijke cellen. Onze aanpak toepasbaar is op andere neurogene zones zoals de hippocampus volwassen en embryonale subgranulaire zone neurogene zones. Ook andere typen kleurstoffen kunnenworden toegepast met de beschreven werkwijze.
Protocol
Discussion
Calcium beeldvorming van SVZ cellen is om patronen te bestuderen in spontane activiteit in neuroblasten 10 receptor kanaal expressie in zowel neuroblasten en astrocyten 4,6,8 en astrocytaire calcium golven 3. Omdat cellen in de SVZ zijn ofwel onrijp of gliale eigenschappen, ze niet ontslaan actiepotentialen 11,12, wat betekent dat milliseconde veranderingen in spanningspotentiaal indicatie van de activiteiten in volwassen netwerken niet van toepassing is in deze regio. Daarom,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (DC007681, AB), CT Stem Cell subsidie (AB), Pardee stichting (AB), Predoctoraal Ruth L. Kirschstein National Research Service Awards (NRSA) (SZY), en een NSF Graduate Research Fellowship (BL). Wij danken de Bordey lab leden voor nuttige commentaar op het manuscript. De huidige materiaal is gebaseerd op het werk mede ondersteund door de staat Connecticut in de Connecticut Stem Cell Research Grants Program. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van de staat Connecticut, het ministerie van Volksgezondheid van de staat Connecticut of CT Innovations, Incorporated.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
References
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
