في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Summary

وقد أبلغ الكيسي تصرف عبر الغشاء منظم التليف (CFTR)، وقناة كلوريد الظهارية، للتفاعل مع مختلف البروتينات وتنظيم العمليات الخلوية الهامة، من بينها قد تم PDZ CFTR عزر بوساطة التفاعلات موثقة توثيقا جيدا. يصف هذا بروتوكول طرق التي قمنا بتطويرها لتجميع الجزيئات CFTR PDZ التي تعتمد على إشارات معقدة<em> في المختبر</em>.

Abstract

الكيسي تصرف عبر الغشاء منظم التليف (CFTR)، وهي قناة كلوريد تقع في المقام الأول على الأغشية قمية من الخلايا الظهارية، يلعب دورا حاسما في توازن السوائل بطريق الظهارة ^1-3. وقد تورط CFTR في اثنين من أهم الأمراض: التليف الكيسي (CF) ⁽⁴⁾ وإفرازي الإسهال ^5. في قوات التحالف، ويتم تقليل توليف أو النشاط الوظيفي للقناة الكلور CFTR. هذا الاضطراب يصيب حوالي 1 في 2500 القوقازيين في الولايات المتحدة ^6. كما تم الإفراط في النشاط CFTR المتورطين في حالات السموم التي يسببها الاسهال إفرازي (على سبيل المثال، بواسطة بكتيريا الكوليرا والحرارة كولاي معوي مستقر) الذي يحفز المخيم أو إنتاج المركب في القناة الهضمية ^7.

تراكم الأدلة تشير إلى وجود تفاعلات المادية والوظيفية بين CFTR وعدد متزايد من البروتينات الأخرى، بما في ذلك شركات النقل، والقنوات الأيونية، والمستقبلات، كاينيسات، phosphatases، إشارةوقد تبين أن الجزيئات جي، وعناصر هيكل الخلية، وهذه التفاعلات بين CFTR وبروتينات لها ملزم للمشاركة حاسمة في تنظيم CFTR بوساطة نقل أيون بطريق الظهارة في المختبر، وأيضا في الجسم الحي ^8-19. في هذا البروتوكول، ونحن نركز فقط على الطرق التي تساعد في دراسة التفاعلات بين ذيل CFTR محطة الكربوكسيل، التي تمتلك عزر بروتين ملزمة [يشار إلى PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) عزر]، و وأشار مجموعة من البروتينات سقالة، والتي تحتوي على وحدة نمطية محددة وملزمة لمثل المجالات PDZ. حتى الآن، تم الإبلاغ عن عدة بروتينات مختلفة PDZ سقالة لربط محطة الذيل الكربوكسيل من CFTR مع الانتماءات المختلفة، مثل NHERF1، NHERF2، PDZK1، PDZK2، CAL (CFTR المرتبطة يجند)، Shank2، وغراسب ^20-27. وعزر PDZ ضمن CFTR معترف بها من قبل البروتينات سقالة PDZ هو آخر أربعة الأحماض الأمينية في محطة C (أي، 1477، DTRL-1480 في CFTR الإنسان) ^20. ومن المثير للاهتمام،يمكن CFTR ربط أكثر من واحد PDZ نطاق كل من NHERFs وPDZK1، وإن كان ذلك بدرجات متفاوتة من الانتماءات ^22. وقد تبين أن هذا multivalency فيما يتعلق ملزم CFTR أن تكون ذات أهمية وظيفية، مما يوحي بأن PDZ البروتينات سقالة قد تسهل تشكيل الجزيئات CFTR يشير مجمعات لإشارات محددة / انتقائي وفعال في الخلايا ^16-18.

وقد وضعت فحوصات الكيمياء الحيوية متعددة لدراسة CFTR، التي تنطوي على تفاعلات البروتين، مثل مناعي المشترك، فحص المنسدلة، زوج من الحكمة فحص ملزم، اللونية الزوج الحكيم فحص ملزمة، وفحص الجزيئات المعقدة الجمعية ^{16-19،28،29} . هنا نركز على الإجراءات التفصيلية لتجميع عزر التي تعتمد على PDZ CFTR المحتوية على الجزيئات المعقدة في المختبر، والذي يستخدم على نطاق واسع من قبل مختبر لدينا لدراسة البروتين البروتين أو المجال نطاق التفاعلات التي تنطوي على CFTR ^{16-19،28،29.}

Protocol

1. التعبير وتنقية البروتينات المؤتلف المرتبطة دلاليا الانصهار في البكتيريا تضخيم مناطق محددة من C-ذيول (آخر 50-100 الأحماض الأمينية التي تحتوي على زخارف PDZ في نهاية-C) لCFTR، LPA 2، MRP2، MRP4، β 2 AR، وNHERFs (بالطول أو المج…

Discussion

في هذا البروتوكول أثبتنا وسيلة لتجميع في المختبر والكشف عن CFTR التي تحتوي على مجمع الجزيئات يشير الى استخدام البروتين النقي (أو أجزاء بروتين) و / أو lysates خلية كما ذكرت سابقا ^{16-19،29،30.} لتحقيق أفضل النتائج في النقاط التالية الحاسمة خلال عملية الإعداد تتطلب اهتم?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
pGEX4T-1 vector	GE Healthcare	28-9545-49	formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector	New England BioLabs
pET30 vector	EMD Chemicals	69077-3	formerly Novagen
Glutathione agarose beads	BD Biosciences	554780
Amylose resin	New England BioLabs	E8021S
Talon beads	Clontech	635501
reduced glutathione	BD Biosciences	554782
imidazole	Fisher	BP305-50
maltose	Fisher	BP684-500
S-protein agarose	EMD Chemicals	69704-3	formerly Novagen
Anti-Flag HRP	Sigma	A8592
Anti-CFTR IgG	Custom-made	R1104	mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG	Chemicon International	MAB4148	Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.