In-vitro-Analyse der PDZ-abhängigen CFTR Makromolekulare Signalkomplexe
Summary
Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), eine epitheliale Chlorid-Kanal, wurde berichtet, dass mit verschiedenen Proteinen zu interagieren und zu regulieren wichtige zelluläre Prozesse, darunter die CFTR PDZ-Motiv-vermittelte Wechselwirkungen sind gut dokumentiert. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die wir entwickelt, um eine PDZ-abhängigen CFTR makromolekularen Signalkomplexes montieren<em> In-vitro-</em>.
Abstract
Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), ein Chlorid-Kanal in erster Linie auf den apikalen Membranen der Epithelzellen befindet, spielt eine entscheidende Rolle bei der transepithelialen Homöostase 1-3. Zystischer Fibrose (CF) 4 und sekretorische Diarrhoe 5: CFTR wurde in zwei der wichtigsten Krankheiten in Verbindung gebracht. Bei CF wird die Synthese oder die funktionelle Aktivität des CFTR-Cl-Kanal reduziert. Diese Erkrankung betrifft etwa 1 von 2500 Kaukasiern in den Vereinigten Staaten sechs. Übermäßige CFTR-Aktivität wurde auch in Fällen von Toxin-induzierte sekretorische Diarrhöe (z. B. durch Cholera-Toxin und hitzestabil E. coli Enterotoxin), die cAMP oder cGMP-Produktion im Darm 7 stimuliert in Verbindung gebracht.
Es gibt zunehmend Hinweise auf die Existenz der physischen und funktionellen Interaktionen zwischen CFTR und einer wachsenden Zahl von anderen Proteinen, einschließlich Transporter, Ionenkanäle, Rezeptoren, Kinasen, Phosphatasen, SignalIng. Moleküle und Zytoskelett-Elemente, und diese Interaktionen zwischen CFTR und ihre bindenden Proteinen wurde gezeigt, dass kritisch bei der Regulierung CFTR-vermittelten transepithelialen Ionentransport in vitro als auch in vivo 8-19 einbezogen werden. In diesem Protokoll, konzentrieren wir uns nur auf die Methoden, die Hilfe bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen CFTR carboxyterminalen Schwanz, der ein Protein-Bindungsmotiv besitzt [bezeichnet als PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) Motiv], und einer Gruppe von Gerüst-Proteine, die eine spezifische Bindung Modul enthalten, bezeichnet als PDZ-Domänen. Bisher wurden verschiedene PDZ Gerüstproteine wurde berichtet, dass die Carboxyl-terminalen Schwanz des CFTR mit verschiedenen Affinitäten wie NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-assoziierten Liganden), SHANK2 binden und GRASP 20-27. Die PDZ-Motivs innerhalb CFTR, die von PDZ Gerüstproteine erkannt wird, ist die letzten vier Aminosäuren am C-Terminus (dh 1477-DTRL-1480 in humanen CFTR) 20. InteressanterweiseCFTR binden können mehr als eine PDZ-Domäne beider NHERFs und PDZK1, wenn auch mit unterschiedlicher Affinitäten 22. Diese Multivalenz bezüglich CFTR Bindung wurde gezeigt, dass von funktionaler Bedeutung sein, was darauf hindeutet, dass PDZ Gerüstproteine kann die Bildung von CFTR makromolekularen Komplexen ermöglichen Signalisierung für spezifische / selektive und effiziente Signalisierung in Zellen 16-18.
Mehrere biochemische Assays wurden entwickelt, um zu studieren CFTR-Protein-Interaktionen beteiligt, wie z. B. Co-Immunopräzipitation, Pull-Down-Assay, paarweise Bindungsassay, kolorimetrische paarweise Bindungsassay und makromolekulare komplexe Montage-Assay 16-19,28,29 . Hier haben wir auf die genauen Verfahren zum Zusammenbau eines PDZ-Motiv-abhängige CFTR-haltigen makromolekularen Komplex in vitro, die ausgiebig in unserem Labor zu Protein-Protein-oder Domain-Domain-Wechselwirkungen unter Beteiligung von CFTR 16-19,28,29 Studie konzentrieren.
Protocol
Discussion
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, ein Verfahren zur In-vitro-Nachweis von Montage und ein CFTR-enthaltenden makromolekularen Signalkomplexes mit gereinigten Proteine (oder Proteinfragmente) und / oder Zell-Lysate, wie zuvor berichtet 16-19,29,30. Um die besten Ergebnisse erzielt die folgenden kritischen Punkte während des Herstellungsverfahrens erfordern besondere Aufmerksamkeit:
- Es ist wichtig, dass der pH des Elutionspuffers auf 8,0 nach Zugabe reduziertem Glutathion bei de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unsere Arbeit wurde durch Zuwendungen von der American Heart Association (Großraum Südost Affiliate) Beginning-Grant-in-Hilfe-0765185B, der Elsa U. Pardee Foundation Research Grant und der Wayne State University intramuralen Gründerfonds und Cardiovascular Research Institute Isis-Initiative ausgezeichnet unterstützt worden. Diese Methode der in vitro CFTR makromolekularen Komplex Montage wurde ursprünglich Pionierarbeit von Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
| pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
| Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon beads | Clontech | 635501 | |
| reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazole | Fisher | BP305-50 | |
| maltose | Fisher | BP684-500 | |
| S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
| Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment.
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