בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות
Summary
סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד אפיתל, דווחה אינטראקציה עם חלבונים שונים לווסת תהליכים תאיים חשובים, ביניהם את PDZ CFTR מוטיב בתיווך אינטראקציות תועדו היטב. פרוטוקול זה מתאר שיטות שפיתחנו כדי להרכיב macromolecular PDZ תלוי CFTR איתות מורכבת<em> במבחנה</em>.
Abstract
סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור המוליכות (CFTR), ערוץ כלוריד נמצא בעיקר בקרום הפסגה של תאים אפיתל, ממלא תפקיד מכריע הומאוסטזיס נוזל transepithelial 1-3. CFTR היה מעורב בשתי מחלות עיקריות: סיסטיק פיברוזיס (CF) 4 ו הפרשה שלשולים 5. ב CF, סינתזה או פעילות פונקציונלית של CFTR Cl ערוצים מצטמצם. הפרעה זו משפיעה על כ 1 ב 2500 לבנים בארצות הברית 6. פעילות CFTR מוגזם גם היה מעורב במקרים של שלשול, הרעלן המושרה הפרשה (למשל, על ידי רעלן כולרה enterotoxin יציבה חום א coli), אשר ממריץ את ייצור cGMP cAMP או במעיים 7.
צבירת ראיות מציע קיומה של אינטראקציה פיזית בין תפקודי CFTR, ומספר גדל והולך של חלבונים אחרים, כולל מובילי, תעלות יונים, רצפטורים, קינאזות, phosphatases, אותותמולקולות תית, ואלמנטים cytoskeletal, וכן את יחסי הגומלין בין CFTR וחלבונים מחייב שלה הוכחו להיות מעורב באופן קריטי בוויסות CFTR בתיווך התחבורה יון transepithelial במבחנה גם in vivo 8-19. בפרוטוקול זה, אנחנו מתמקדים רק השיטות המסייעים בחקר יחסי הגומלין בין זנב מסוף carboxyl CFTR, אשר מחזיק מוטיב חלבון מחייב [המכונה PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) מוטיב], ו קבוצה של פיגום חלבונים, אשר מכילים מודול מחייב ספציפית המכונה תחומים PDZ. עד כה, כמה חלבונים שונים PDZ הפיגום דווחו להיקשר זנב מסוף carboxyl של CFTR עם זיקות שונות, כגון NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR הקשורים ליגנד), Shank2, ולתפוס 20-27. מוטיב PDZ בתוך CFTR, שמוכר על ידי PDZ פיגום חלבונים הוא האחרון ארבע חומצות אמינו בתחנה הסופית C (כלומר, 1477, DTRL-1480 ב CFTR אדם) 20. מענייןCFTR יכולה לאגד יותר מושלם PDZ של שני NHERFs ו PDZK1, אם כי עם שינוי זיקות 22. Multivalency זה ביחס CFTR מחייב הוכח להיות בעל משמעות תפקודית, דבר המצביע על כך PDZ חלבונים הפיגום יכול להקל על היווצרות macromolecular CFTR איתות קומפלקסים של איתות ספציפיים / סלקטיביים ויעיל בתאים 16-18.
מבחני ביוכימיים רבים פותחו ללמוד CFTR-מעורבים אינטראקציות חלבון, כגון immunoprecipitation משותפת, הנפתח assay, זוג מבחינת assay מחייב, assay colorimetric זוג מבחינת מחייב, והרכבה מורכב macromolecular assay 16-19,28,29 . כאן נתמקד הנהלים המפורטים של הרכבת מוטיב תלוי PDZ CFTR המכיל macromolecular מורכב במבחנה, שבו נעשה שימוש נרחב על ידי המעבדה שלנו ללמוד חלבונים או תחום תחומים אינטראקציות מעורבים CFTR 16-19,28,29.
Protocol
Discussion
בפרוטוקול זה הראינו שיטה במבחנה הרכבה זיהוי של CFTR המכיל קומפלקס macromolecular איתות באמצעות חלבונים מטוהרים (או שברי חלבונים) ו / או lysates סלולריים כפי שדווח בעבר 16-19,29,30. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר הנקודות הבאות קריטיות בתהליך ההכנה דורשים התייחסות מיוחדת: …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה שלנו כבר נתמך על ידי תרומות של איגוד הלב האמריקני (שותפים רבתי דרום מזרח) התחלת-מענק-in-0765185B סיוע, ע 'אלזה Pardee קרן מענק מחקר, ויין סטייט קרן ההפעלה עירונית, לב וכלי דם מכון המחקר איזיס הפרס היוזמה. שיטה זו של באסיפה חוץ גופית CFTR מורכב macromolecular היה במקור חלוץ ידי ד"ר AP Naren (אוניברסיטת טנסי למדעי הבריאות מרכז).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
| pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
| Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon beads | Clontech | 635501 | |
| reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazole | Fisher | BP305-50 | |
| maltose | Fisher | BP684-500 | |
| S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
| Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
- Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
- Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
- Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
- Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
- Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
- Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
- Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
- McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
- Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
- Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D., Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
- Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
- Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
- Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
- Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
- Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
- Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
- Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
- Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
- Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
- Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
- Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
- Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
- Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
- Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
- Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
- Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
- Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
- Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
- Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
- Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. , (2011).
