Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização
Summary
A fibrose cística regulador da condutância transmembranar (CFTR), um canal de cloreto epitelial, tem sido relatado para interagir com várias proteínas e regulam importantes processos celulares, entre eles os CFTR PDZ motivo mediadas-interacções têm sido bem documentados. Este protocolo descreve métodos desenvolvidos para montar um macromolecular CFTR PDZ-dependente sinalização complexo<em> In vitro</em>.
Abstract
A fibrose cística reguladora da condutância transmembrana (CFTR), um canal de cloreto localizados principalmente nas membranas apicais das células epiteliais, desempenha um papel crucial na homeostasia de fluidos transepitelial 1-3. CFTR tem sido implicado em duas doenças principais: fibrose cística 4 (CF) e secretora diarreia 5. Na FC, a síntese ou a actividade funcional do CFTR Cl-canal é reduzida. Esta doença afecta cerca de 1 em 2500 caucasianos nos Estados Unidos 6. Actividade CFTR excessiva também tem sido implicado em casos de toxina induzida por diarreia secretória (por exemplo, por toxina da cólera e enterotoxina calor coli estável E.) que estimula a produção de cAMP ou cGMP no intestino 7.
Evidências sugerem a existência de interações físicas e funcionais entre CFTR e um número crescente de outras proteínas, incluindo os transportadores, canais iônicos, receptores, quinases, fosfatases, sinalmoléculas ing, e os elementos do citoesqueleto, e estas interacções entre CFTR e as suas proteínas de ligação têm sido mostrados para ser criticamente envolvidos na regulação mediada por CFTR transporte de iões transepitelial in vitro e também in vivo 8-19. Neste protocolo, vamos nos concentrar apenas sobre os métodos que auxiliam no estudo das interações entre CFTR cauda carboxilo terminal, que possui um motivo de ligação às proteínas [referido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], e um grupo de andaime proteínas, que contêm um módulo de ligação específica referida como domínios PDZ. Até agora, várias proteínas diferentes PDZ andaime têm sido relatados para se ligar ao terminal carboxilo da cauda de CFTR, com afinidades diferentes, tais como NHERF1 e NHERF2 e PDZK1 e PDZK2, CAL (CFTR-associated ligando), Shank2, e agarrar 20-27. O motivo PDZ dentro CFTR que é reconhecido pelo PDZ andaime proteínas são os últimos quatro aminoácidos no terminal C (ie, 1477-DTRL-1480 em CFTR humano) 20. Curiosamente,CFTR pode ligar mais do que um domínio PDZ de ambos os NHERFs e PDZK1, embora com diferentes afinidades 22. Este multivalência com respeito à ligação CFTR foi mostrado para ser de importância funcional, sugerindo que as proteínas PDZ andaime pode facilitar a formação de complexos macromoleculares CFTR sinalização para a sinalização específicas / selectiva e eficaz em células 16-18.
Vários ensaios bioquímicos têm sido desenvolvidos para estudar CFTR-envolvendo interacções proteína, tais como co-imunoprecipitação, suspenso ensaio, pares ensaio de ligação, por pares de ensaio colorimétrico de ligação, e doseamento macromolecular montagem complexa 16-19,28,29 . Aqui vamos nos concentrar sobre os procedimentos detalhados de montagem de um PDZ motivo dependente da CFTR macromolecular contendo complexo in vitro, que é usado amplamente por nosso laboratório para estudar proteína-proteína ou domínio domínio interações envolvendo CFTR 16-19,28,29.
Protocol
Discussion
Neste protocolo que demonstraram um método para a montagem in vitro e detecção de um complexo macromolecular CFTR contendo sinalização utilizando proteínas purificadas (ou fragmentos de proteínas) e / ou lisados celulares como relatado anteriormente 16-19,29,30. Para alcançar melhores resultados os seguintes pontos críticos durante o processo de preparação requerem especial atenção:
- É importante que o pH do tampão de eluição ser ajustado para 8,0 após a adição d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nosso trabalho foi suportado por concessões do American Heart Association (Grande Afiliado Sudeste) A partir de doações em ajuda-0765185B, a Elsa U. Pardee Foundation bolsa de investigação, e Wayne State University fundo de inicialização intramural e Cardiovascular Research Institute prêmio Iniciativa de Isis. Este método de in vitro conjunto complexo macromolecular CFTR foi originalmente pioneira pelo Dr. AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
| pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
| Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon beads | Clontech | 635501 | |
| reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazole | Fisher | BP305-50 | |
| maltose | Fisher | BP684-500 | |
| S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
| Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment.
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