Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR

Summary

Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloro del epitelio, se ha informado de interactuar con varias proteínas y regular procesos celulares importantes, entre ellos los CFTR PDZ mediadas por motivo de las interacciones han sido bien documentados. Este protocolo describe los métodos que hemos desarrollado para montar un macromolecular CFTR PDZ-dependiente de señalización complejos<em> In vitro</em>.

Abstract

Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloruro encuentra principalmente en la membrana apical de las células epiteliales, juega un papel fundamental en la homeostasis de los fluidos ^1-3 transepitelial. CFTR se ha implicado en dos enfermedades importantes: la fibrosis quística (FQ) ⁴ y la diarrea secretora ^5. En CF, la síntesis o la actividad funcional de la CFTR Cl-canal se reduce. Este trastorno afecta a aproximadamente 1 de cada 2,500 caucásicos en los Estados Unidos ^6. La actividad del CFTR excesiva también ha sido implicado en casos de toxina inducida diarrea secretora (por ejemplo, por la toxina del cólera y estable al calor enterotoxina de E. coli) que estimula la producción de AMPc o GMPc en el intestino ^7.

La acumulación de pruebas sugieren la existencia de interacciones físicas y funcionales entre CFTR y un número creciente de otras proteínas, incluyendo transportadores, canales iónicos, receptores, quinasas, fosfatasas, la señalIng. moléculas, y los elementos del citoesqueleto, y estas interacciones entre CFTR y sus proteínas de unión se ha demostrado que ser críticamente involucrada en la regulación mediada por CFTR transporte iónico transepitelial in vitro y también in vivo ^8-19. En este protocolo, nos centraremos únicamente en los métodos que ayudan en el estudio de las interacciones entre la cola CFTR carboxilo terminal, que posee un motivo de unión a proteínas [conocido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], y un grupo de proteínas de andamiaje, que contienen un módulo de unión específica a que se refiere a dominios PDZ. Hasta ahora, varios diferentes PDZ proteínas de andamiaje se ha informado que se unen a la cola carboxilo terminal de CFTR con afinidades diferentes, tales como, las NHERF1 NHERF2, los PDZK1, los PDZK2, Cal (CFTR asociada a ligando), Shank2, y GRASP ^20-27. El motivo PDZ en CFTR que es reconocido por PDZ proteínas de andamiaje son los últimos cuatro aminoácidos en el terminal C (es decir, 1477-DTRL-1480 en el ser humano CFTR) ^20. Curiosamente,CFTR puede obligar a más de un dominio PDZ de ambos NHERFs y PDZK1, aunque con distintas afinidades ^22. Esta multivalencia con respecto a CFTR unión ha demostrado ser de importancia funcional, lo que sugiere que las proteínas PDZ andamio puede facilitar la formación de complejos macromoleculares CFTR señalización para la señalización específicos / selectiva y eficiente en las células ^16-18.

Múltiples ensayos bioquímicos se han desarrollado para estudiar CFTR que implica interacciones de proteínas, como la co-inmunoprecipitación, ensayo de pull-down, por pares ensayo de unión, colorimétrico pares ensayo de unión, y el ensayo de ensamblaje complejo macromolecular ^16-19,28,29 . Aquí nos centramos en las particularidades del procedimiento de montaje de un PDZ motivo dependiente de CFTR que contiene complejo macromolecular in vitro, que se utiliza ampliamente en nuestro laboratorio para estudiar proteína-proteína o de dominio de dominio-interacciones que implican CFTR ^16-19,28,29.

Protocol

1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes de fusión con la etiqueta en las bacterias Amplificar las regiones definidas de la C-colas (en los últimos 50-100 aminoácidos que contienen los motivos PDZ en C-terminal) de CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, y NHERFs (de larga duración o dominios PDZ1 o PDZ2 ) por el método PCR. Clonar los productos de PCR en pGEX4T-1 vector de fusión GST-proteínas (como GST-NHERFs, GST-MRP4 TC), pMAL-C2 vector de las proteínas d…

Discussion

En este protocolo, se demostró un método para ensamblar in vitro y la detección de un complejo macromolecular que contiene CFTR señalización utilizando proteínas purificadas (o fragmentos de proteínas) y / o lisados ​​de células como se informó anteriormente ^16-19,29,30. Para lograr los mejores resultados los siguientes puntos críticos durante el proceso de preparación requieren una atención especial:

• Es importante que el pH del tampón de elución se ajustó a 8,0 despu?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
pGEX4T-1 vector	GE Healthcare	28-9545-49	formerly Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector	New England BioLabs
pET30 vector	EMD Chemicals	69077-3	formerly Novagen
Glutathione agarose beads	BD Biosciences	554780
Amylose resin	New England BioLabs	E8021S
Talon beads	Clontech	635501
reduced glutathione	BD Biosciences	554782
imidazole	Fisher	BP305-50
maltose	Fisher	BP684-500
S-protein agarose	EMD Chemicals	69704-3	formerly Novagen
Anti-Flag HRP	Sigma	A8592
Anti-CFTR IgG	Custom-made	R1104	mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734
Anti-MRP2 IgG	Chemicon International	MAB4148	Now a part of Millipore

Table 2. Specific reagents and equipment.