In vitro analys av PDZ-beroende Signaling CFTR makromolekylära komplex
Summary
Cystisk fibros transmembran konduktans-regulator (CFTR), en epitelial kloridkanal, har rapporterats interagera med olika proteiner och reglera viktiga cellulära processer, däribland de CFTR PDZ-motivet-medierade interaktioner har dokumenterats väl. Detta protokoll beskriver metoder vi utvecklat för att montera en PDZ-beroende CFTR makromolekylära signalering komplex<em> In vitro</em>.
Abstract
Cystisk fibros transmembran konduktans (CFTR), en kloridkanal belägen främst på de apikala membranen i epitelceller, spelar en avgörande roll i transepitelial vätska homeostas 1-3. CFTR har varit inblandad i två stora sjukdomar: cystisk fibros (CF) 4 och sekretoriska diarré 5. I CF är syntes eller funktionella aktiviteten av CFTR Cl-kanalen minskas. Denna störning drabbar cirka 1 på 2.500 vita i USA 6. Överdriven CFTR aktivitet har också varit inblandad i fall av toxin-inducerad sekretoriska diarré (t.ex. genom kolera toxin och värme stabilt E. coli enterotoxin) som stimulerar cAMP eller cGMP produktion i tarmen 7.
Ackumulerande bevis tyder på förekomsten av fysiska och funktionella interaktioner mellan CFTR och ett växande antal andra proteiner, inklusive transportörer, jonkanaler, receptorer, kinaser, fosfataser, signalIng-molekyler, och cytoskelettala element och dessa interaktioner mellan CFTR och dess bindande proteiner har visat sig vara kritiskt involverade i regleringen av CFTR-medierad transepitelial jontransport in vitro och även in vivo 8-19. I detta protokoll, fokuserar vi bara på de metoder som stöd i studiet av samspelet mellan CFTR karboxylterminala svans, som har en protein-bindande motiv [kallas PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motiv] och en grupp byggnadsställning proteiner, vilka innehåller en specifik bindningspartner modul kallad PDZ domäner. Hittills har flera olika PDZ ställningsdelar proteiner har rapporterats binda till den karboxylterminala änden av CFTR med olika affiniteter, såsom NHERF1 och NHERF2 och PDZK1 och PDZK2, CAL (CFTR-associerad ligand), Shank2, och gripa 20-27. Den PDZ motivet inom CFTR som är erkänd av PDZ ställning proteiner är de sista fyra aminosyrorna vid C-terminalen (dvs. 1477-DTRL-1480 i mänsklig CFTR) 20. Intressant nogCFTR kan binda mer än en PDZ-domänen av både NHERFs och PDZK1, om än med varierande affinitet 22. Detta multivalens med avseende på CFTR bindning har visat sig vara av funktionell betydelse, vilket antyder att PDZ ställningsdelar proteiner kan underlätta bildning av CFTR makromolekylär signalering komplex för specifika / selektiva och effektiva signalering i celler 16-18.
Flera biokemiska analyser har utvecklats för att studera CFTR-involvera proteininteraktioner, såsom sam-immunoutfällning, neddragningstransistor analys parvisa bindningsanalys, kolorimetrisk parvisa bindningsanalys och makromolekylärt komplex sammansättning analys 16-19,28,29 . Här fokuserar vi på de detaljerade förfaranden för montering en PDZ motiv-beroende CFTR-innehållande makromolekylära komplex in vitro, som används i stor utsträckning av vårt laboratorium för att studera protein-protein eller domän-domän interaktioner mellan CFTR 16-19,28,29.
Protocol
Discussion
I detta protokoll vi visat ett förfarande för in vitro montering och detektering av en CFTR-innehållande makromolekylärt komplex signalering genom att använda renade proteiner (eller proteinfragment) och / eller cellysat som rapporterats tidigare 16-19,29,30. För att uppnå bästa resultat följande kritiska punkter under beredningsprocessen kräver särskild uppmärksamhet:
- Det är viktigt att pH för elueringsbufferten justeras till 8,0 efter tillsats av reducerat glutation vid r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vårt arbete har finansierats med bidrag från American Heart Association (Greater sydöstra Affiliate) Början-bidrag-i-bistånd 0765185B, Elsa U. Pardee Foundation forskningsanslag, och Wayne State University intramural start fonden och Hjärt Forskningsinstitut Isis Initiative utmärkelse. Denna metod för in vitro-CFTR makromolekylära komplex sammansättning ursprungligen uppfunnen av Dr AP Naren (University of Tennessee Health Science Center).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
| pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
| pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
| Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
| Talon beads | Clontech | 635501 | |
| reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
| imidazole | Fisher | BP305-50 | |
| maltose | Fisher | BP684-500 | |
| S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
| Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
| Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
| Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment.
References
- Anderson, M. P. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity. Science. 253, 202-205 (1991).
- Bear, C. E. Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR. Cell. 68, 809-818 (1992).
- Quinton, P. M. Chloride impermeability in cystic fibrosis. Nature. 301, 421-422 (1983).
- Cheng, S. H. Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis. Cell. 63, 827-834 (1990).
- Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model. Science. 266, 107-109 (1994).
- Li, C., Naren, A. P. CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners. Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).
- Chao, A. C. Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase. Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).
- Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship. Nature. 363, 263-268 (1993).
- McNicholas, C. M. Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).
- Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells. J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).
- Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D., Soleimani, M. CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF. Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).
- Ahn, W. Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct. J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).
- Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates. Embo. J. 17, 898-908 (1998).
- Naren, A. P. Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms. Nature. 390, 302-305 (1997).
- Naren, A. P. Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents. J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).
- Naren, A. P. A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).
- Li, C. Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions. J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).
- Li, C. Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia. Cell. 131, 940-951 (2007).
- Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer. Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).
- Hall, R. A. A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).
- Short, D. B. An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).
- Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity. Cell. 103, 169-179 (2000).
- Sun, F. E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells. J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).
- Cheng, J. A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression. J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).
- Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor. The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).
- Lee, J. H. Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors. The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).
- Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway. Cell. 146, 746-760 (2011).
- Naren, A. P. Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function. Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).
- Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane. The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).
- Li, C., Naren, A. P. Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes. Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).
- Wu, Y. A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases. J. Biol. Chem. , (2011).
