Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), epitelyal bir klor kanalı, çeşitli proteinler ile etkileşim ve önemli hücre süreçlerini düzenleyen bildirilmiştir; aralarında CFTR PDZ motifi aracılı etkileşimleri de belgelenmiştir. Bu protokol bizim karmaşık bir sinyal PDZ bağımlı CFTR makromoleküler birleştirmek için geliştirilen yöntemler açıklanır<em> In vitro</em>.
Kistik fibrozis transmembran kondüktans regülatörü (CFTR), öncelikle epitel hücrelerinin apikal hücre zarlarında bulunan bir klor kanalı, 1-3 transepitelyal sıvı dengesinin önemli bir rol oynar. Kistik fibrozis (CF) 4 ve sekretuar ishal 5: CFTR iki önemli hastalıklarla ilişkisi olmuştur. CF, CFTR Cl-kanalının sentez ya da işlevsel aktivitesini azalır. Bu hastalık Amerika Birleşik Devletleri'nde 2500 Kafkasyalılar 6 yaklaşık 1 etkiler. Aşırı CFTR etkinliği de cAMP veya bağırsak 7 cGMP üretimini uyarır toksin kaynaklı sekretuar ishal (örneğin, kolera toksini ve ısıya dayanıklı enterotoksin tarafından E. coli) durumlarında ortaya konmuştur.
Biriken deliller CFTR ve taşıyıcılar, iyon kanalları, reseptörler, kinazlar, fosfatazlar, sinyal dahil olmak üzere diğer proteinler giderek artan sayıda, arasındaki fiziksel ve fonksiyonel etkileşimlerin varlığını aklaING molekülleri ve sitoskeletal elemanları ve CFTR ve bağlayıcı protein arasındaki bu etkileşimlerin kritik in vitro ve in vivo da 8-19 CFTR-aracılı transepitelyal iyon taşıma düzenleyen dahil edilmesi gösterilmiştir. Bu protokol, biz sadece yöntemleri üzerinde durulacak bir protein bağlayan bir motif sahip CFTR karboksil terminal kuyruk arasındaki etkileşimlerin çalışmada yardım ve [motifi PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) olarak anılacaktır] Belirli bir bağlayıcı modülü ihtiva iskelesi proteinlerin grubu PDZ etki olarak anılacaktır. Şimdiye kadar, birkaç farklı PDZ iskele proteinler gibi NHERF1 gibi çeşitli akrabalıklar, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR ilişkili ligand), Shank2 ile CFTR karboksil terminal kuyruk bağlamak ve 20-27 ÇIKAN bildirilmiştir. PDZ iskele proteinler tarafından tanınır CFTR içinde PDZ motifi C terminus (yani, insan KFTR 1477-DTRL-1480) 20 son dört amino asitler olduğu. İlginç bir şekilde,CFTR akrabalıklar 22 farklı da olsa, NHERFs ve PDZK1 hem birden fazla PDZ alanı bağlayabilirsiniz. CFTR bağlayıcı bakımından Bu çok-değerliğine PDZ iskelesi proteinleri hücreleri 16-18 seçici / spesifik ve verimli bir sinyalleşme için kompleksleri sinyalleşme CFTR makromoleküler oluşumunu kolaylaştıran olabileceğini düşündürmektedir işlevsel bir öneme sahip olduğu gösterilmiştir.
Çoklu biyokimyasal testler incelemek için geliştirilmiştir CFTR-içeren bu işbirliğinin immünopresipitasyon, açılan tayini, çifti-bilge birleştirme testi, kolorimetrik çifti-bilge birleştirme testi ve makromoleküler karmaşık bir montaj test 16-19,28,29 gibi protein etkileşimleri, . Burada protein-protein ya da CFTR 16-19,28,29 içeren etki alanı etki alanı etkileşimlerini incelemek için laboratuvar tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır in vitro, karmaşık bir PDZ motifi bağımlı CFTR içeren makromoleküler montaj ayrıntılı yordamlar odaklanın.
Bu protokolde Bu şekilde, daha önce 16-19,29,30 bildirilen in vitro monte edilmesi ve saflaştırılmış protein (ya da proteininin parçacıkları) ve / veya hücre lizatları kullanılarak makromoleküler sinyalleşme kompleksi ihtiva eden bir CFTR tespiti için bir yöntemi göstermektedir. Hazırlık sürecinde iyi sonuçlar aşağıdaki kritik noktalar elde etmek için özel dikkat gerektirir:
The authors have nothing to disclose.
Çalışmalarımız Amerikan Kalp Derneği (Büyük Güneydoğu Ortaklık) Başlangıç-devlet yardımı 0765185B, Elsa U. Pardee Vakfı'nın araştırma bursu ve Wayne State Üniversitesi intramural başlangıç fonu ve Damar Araştırma Enstitüsü İsis Girişimi ödülü gelen hibelerle desteklenmektedir. In vitro CFTR makromoleküler karmaşık montaj Bu yöntem başlangıçta Dr AP Naren (Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi) tarafından öncülük edilmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
pGEX4T-1 vector | GE Healthcare | 28-9545-49 | formerly Amersham Biosciences |
pMAL-C2 vector | New England BioLabs | ||
pET30 vector | EMD Chemicals | 69077-3 | formerly Novagen |
Glutathione agarose beads | BD Biosciences | 554780 | |
Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | |
Talon beads | Clontech | 635501 | |
reduced glutathione | BD Biosciences | 554782 | |
imidazole | Fisher | BP305-50 | |
maltose | Fisher | BP684-500 | |
S-protein agarose | EMD Chemicals | 69704-3 | formerly Novagen |
Anti-Flag HRP | Sigma | A8592 | |
Anti-CFTR IgG | Custom-made | R1104 | mAb recognizing CFTR epitope at a.a. 722-734 |
Anti-MRP2 IgG | Chemicon International | MAB4148 | Now a part of Millipore |
Table 2. Specific reagents and equipment.