Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)
Summary
يتم قياس طوبولوجيا من التصاق الخلية على ركيزة بدقة نانومتر بواسطة متغير الزاوية الداخلية انعكاس مجموع المجهري مضان (VA-TIRFM).
Abstract
يتم تحديد سطح طوبولوجيا، على سبيل المثال من الخلايا المتزايد على ركيزة، بدقة نانومتر بواسطة متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM). تزرع الخلايا على شرائح شفافة وحضنت مع علامة نيون متجانس في توزيع غشاء البلازما الخاصة بهم. الإضاءة يحدث من قبل شعاع الليزر موازية تحت زوايا متغير من التأمل الداخلي الإجمالي (TIR) مع اختراق أعماق مختلفة من المجال الكهرومغناطيسي زائل. تسجيل الصور مضان على التشعيع في حوالي 10 زوايا مختلفة يسمح لحساب الخلية الركيزة المسافات مع دقة بضعة نانوميتر. وبالتالي يتم تحديد الاختلافات في الالتصاق بين مختلف خطوط الخلايا، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الخبيثة أقل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فحص التغييرات المحتملة من التصاق الخلية عند الكيميائية أو العلاج الضوئي. بالمقارنة مع غيرها من أساليب فائقة القرار يتم الاحتفاظ المجهر التعرض للضوءومن المتوقع الضرر صغيرة جدا، وليس من الخلايا الحية أن تحدث.
Introduction
عندما شعاع ضوء نشر من خلال وسيط من ن معامل الانكسار 1 يلتقي واجهة لوسيلة الثاني من معامل الانكسار ن 2 <ن 1، الانعكاس الداخلي الكامل يحدث في جميع زوايا Θ الإصابة، والتي هي أكبر من الزاوية الحرجة = Θ ج جيب الزاوية القوسي (ن 2 / ن 1). على الرغم من أن تنعكس تماما شعاع ضوء الحادث يثير حقل الكهرومغناطيسي التي تخترق زائل في المتوسطة الثانية ويضمحل بشكل كبير، مع عمودي المسافة Z من واجهة وفقا لI (ض) = I 0 EZ / د (Θ). I (ض) يتوافق مع شدة المجال الكهرومغناطيسي ود (Θ) إلى عمق الاختراق في الطول الموجي λ، كما تم تقديمها من قبل
د (Θ) = (λ/4π) (ن 1 2 2 الخطيئة Θ – ن 2 2) -1 / 2
كما ورد في الأدب 1،2، I 0 </sيو بي> يتوافق مع شدة الضوء الساقط مضروبا I ه مع ناقل حركة T عامل (Θ) ونسبة ن 2 / ن 1. إذا كان الحقل الكهربائي المتجه من هذا شعاع ضوء عمودي الاستقطاب لطائرة من الإصابة (أي طائرة امتدت من جراء الحادث وينعكس شعاع)، ويرد هذا العامل انتقال المرض من خلال
T (Θ) = 4 جتا 2 Θ / [1 – (ن 2 / NL 1) 2]
لكثافة مضان الكشف في القياسات TIRFM، امتصاص الضوء يجب أن تكون متكاملة على جميع طبقات من العينة وتضاعفت مع العائد مضان η الكم من الصبغة ذات الصلة وكذلك مع زاوية صلبة من Ω الكشف. وكما ذكر سابقا 3 يمكن أن توصف هذه الكثافة من قبل
I F (Θ) = AT (Θ) شو (ض) E-Z / د (Θ) DZ
إذا جميع العوامل التي هي مستقلة و يمكن حلها المضغوط يتم تضمين زاوية السقوط Θ وZ تنسيق داخل المعادلة A. ثابت التجريبية 3 التحليلية، إذا تم اعتبار تركيز ج (ض) من fluorophores أن تكون ثابتة تقريبا
– إما في جميع Δ ≥ Z إحداثيات، على سبيل المثال داخل السيتوبلازم من الخلايا وجود Δ المسافة من واجهة. في هذه الحالة، لابد من لا يتجزأ من حساب Δ = Z = ∞ إلى الياء مما أدى إلى
I F = A ج T (Θ) د (Θ) E-Δ / د (Θ)
– أو بين Z = Δ – T / 2 و z = Δ + T / 2، أي في غضون طبقة رقيقة من سمك ر، على سبيل المثال غشاء الخلية تقع على مسافة Δ من واجهة. في هذه الحالة، يمكن حساب كثافة مضان كما
I F = A ج T (Θ) TE-Δ / د (Θ)،
إذا ر صغير بالمقارنة مع Δ.
وكما ذكر سابقا 3 الحصول على الصور، ويتطلب التقييم
– توزيع متجانس للضوء أكثر إثارة العينة،
– صلاحية نموذج 2-طبقة (مع مؤشرات الانكسار ن 1 ن 2 لوالركيزة والسيتوبلازم، على التوالي). هذا يحمل، إذا كان غشاء البلازما هي رقيقة جدا، وإذا كانت الطبقة المتوسطة من خارج الخلية (بين الخلية والركيزة) صغير مقارنة مع الطول الموجي للضوء الحادث.
وبالإضافة إلى ذلك، فتحة معتدلة العددية(عادة A ≤ 0.90) من عدسة المجهر الهدف هو مفيد لتجنب الانحرافات من السطوع بسبب تباين الإشعاع في حقل بالقرب من واجهة عازلة.
Protocol
Discussion
ووصف طريقة لقياس الخلايا بدقة الركيزة مسافات نانومتر. في الوقت الحاضر، وطرق فائقة القرار المجهر، مثلا على أساس منظم الإضاءة 7 أو على واحد 8-10 كشف جزيء وكذلك حفز استنفاد الانبعاثات (STED) المجهري 11 هي ذات أهمية كبيرة. أي من هذه التقنيات، ومع ذلك، يسم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر لاند ولاية بادن فورتمبيرغ والاتحاد فندق Europäischer Europäische فون FÜR يموت ENTWICKLUNG regionale – للحصول على تمويل ZAFH الفوتون N، الفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF) لتمويل منحة بحثية لا. 1792C08 وكذلك شركة محدودة ولاية بادن فورتمبيرغ، ستيفتونغ لتمويل مشروع "Aurami".
Materials
| Name | Company | Type | Comments |
| Incubator | Nunc | Nunc Cellstar QM1300SVBA |
|
| Laminar flow | Holten Safe | S2010 1.2 EN GG 1LN | |
| DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin | BIOCHROM | Cultivation medium | |
| Glass object slides | Marienfeld | Pure white glass | Special cleaning procedure used |
| 6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan) | Molecular Probes | Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol) | |
| Microscope | Carl Zeiss | Axioplan 1 | |
| Laser diode | PicoQuant | LDH 400 with driver PDL 800-B | Wavelength: 391 nm |
| Single mode fiber system | Point Source | kineFlex | Used with collimating optics |
| EMCCD camera | Andor | DV887DC | Back illuminated camera |
References
- Gingell, D., Todd, I. Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement. Biophys. J. 26, 507-526 (1979).
- Reichert, W. M., Truskey, G. A. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence. J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).
- Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device. J. Microsc. 211, 19-29 (2003).
- Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields. Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).
- Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM). J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).
- Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution. J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).
- Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).
- Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. STED microscopy with continuous wave beams. Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).
- Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells. J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).
- Dougherty, T. J. Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours. Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).
- Ölveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Schneckenburger, H. Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).
