Nanotopology של הידבקות תא מיקרוסקופי על משתנה זווית פנימית סה"כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM)

Summary

הטופולוגיה של הידבקות תא על מצע נמדדת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית הפנימית מוחלטת השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM).

Abstract

טופולוגיה פני שטח, למשל של גידול תאים על מצע, נקבעת בדייקנות ננומטר ידי מיקרוסקופי משתנה זווית פנימית סה"כ השתקפות פלואורסצנטי (VA-TIRFM). תאי מעובדות בשקופיות שקופות ודגרו במרקר זרחני המופץ הומוגנית בקרום הפלזמה שלהם. הארה מתרחשת על ידי קרן ליזר מקבילה, על פי זוויות משתנות של ההשתקפות הפנימית מוחלטת (TIR) ​​עם מעמקי חדירה שונים של השדה האלקטרומגנטי החולפים. הקלטה של ​​תמונות פלואורסצנציה על קרינה בכ 10 זוויות שונות מאפשרת לחשב מרחקי תא מצע עם דיוק של ננומטרים ספורים. הבדלים של הדבקה בין קווים שונים של תאים, תאים סרטניים ותאים למשל פחות ממאירים, נקבעים כך. בנוסף, שינויים אפשריים של הידבקות תא על כימי או טיפול פוטודינמי יכולים להיבחן. בהשוואה לשיטות אחרות של סופר רזולוצית חשיפה לאור מיקרוסקופיה נשמרהקטן מאוד, ולא נגרם ניזק של תאי חיים צפוי להתרחש.

Introduction

כאשר קרן אור מתפשטת דרך מדיום של המדד N ₁ שבירה עונה ממשק למדיום שני של מקדם שבירת n _{2 <1} n, ההשתקפות הפנימית מוחלטת מתרחשת בכל הזוויות של השכיחות Θ, שהם גדולים יותר מהזווית הקריטית Θ _ג = arcsin (n ₂ / n _1). למרות ששקף לחלוטין את אלומת אור התקרית מעוררת שדה האלקטרומגנטי חלוף שחודר לתוך המדיום והדועך אקספוננציאלית עם ניצב מרחק z מהממשק 2 לפי (z) = ₀ אני ^{_{ez / ד (Θ).}} אני (z) תואם את עוצמת השדה האלקטרומגנטי וד (Θ) לעומק החדירה באורך הגל λ, כפי שנמסר על ידי

ד (Θ) = (λ/4π) ₍₁ ² חטא n ² Θ – n _{² 2)} ^{-1 /} ₂

כפי שדווח בספרות ^1,2, אני ₀ </sUB> מתאים לעוצמת אור תקרית _שהדואר מוכפל בהעברת הגורם T (Θ) והיחס n ₂ / n _1. אם וקטור השדה החשמלי של קרן האור מקוטב זה ניצב למישור פגיע (כלומר המטוס מורחב על ידי האירוע והקרן משתקפת), גורם תמסורת זו ניתן על ידי

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 – (n ₂ / NL ₁₎ ^2]

לעוצמת הקרינה התגלתה במדידות TIRFM, ספיגת אור צריכה להיות משולבת על כל השכבות של המדגם והתרבה ​​עם פלואורסצנטי קוונטי התשואה η של הצבע הרלוונטי, כמו גם עם הזווית המוצקה של זיהוי Ω. כפי שדווח בעבר ^3, בעצמה זו יכולה להיות מתוארת על ידי

אני _F (Θ) = AT (Θ) OC (z) ^{דואר z / ד (Θ)} dz

אם כל הגורמים שהם f עצמאי rom זווית פגיעת Θ והקואורדינטה z כלול בתוך משוואת א המתמדת הניסיונית 3 ניתן לפתור אנליטית, אם הריכוז ג (z) של fluorophores נחשב להיות כמעט קבוע

– או בכל הקואורדינטות z ≥ Δ, למשל בתוך הציטופלסמה של תאים בעלי מרחק Δ מהממשק. במקרה זה, יש נפרד, שיחושב מz = Δ לz = ∞ וכתוצאה מכך

אני _F = ג T (Θ) ד (Θ) ^{דואר Δ / ד (Θ)}

– או בין z = Δ – t / 2 ו-Z = Δ + t / 2, כלומר בתוך שכבה דקה של t עובי, למשל קרום תא ממוקם במרחק Δ מהממשק. במקרה זה, עוצמת הקרינה יכולה להיות מחושבת כ

אני _F = ג T (Θ) ^{טה-Δ / ד (Θ),}

אם לא הוא קטן בהשוואה לΔ.

> "אף אוזן גרון ממשוואות (4) ו (5) מרחקי תא מצע Δ ניתן לחשב, אם תמונות של עוצמת קרינה אני _F נרשמים לזוויות משתנות Θ, ואם ln (אני _F / T ד) (Eq. 4) או ln (אני _F / T) (Eq. 5) מוערך כפונקציה של 1 / ד לזוויות אלה. לקרום סמן laurdan השתמש בנייר הזה (סעיף להלן) ההערכה בוצעה על פי משוואה. 5.

כפי שדווח בעבר ^3, תמונת רכישה וההערכה דורשת
– הפצה הומוגני של אור עירור על המדגם,
– תוקפו של מודל 2-שכבה (עם מדדי שבירת n ₁ ו n ₂ למצע וציטופלסמה, בהתאמה). זה מחזיק, אם קרום הפלזמה הוא דק מאוד, ואם השכבה של מדיום החוץ התאי (בין התא והמצע) היא קטנה בהשוואה לאורך הגל של אור אירוע.

בנוסף, צמצם מספרי מתון(בדרך כלל ≤ 0.90) של עדשת המיקרוסקופ המטרה הוא יתרון, כדי למנוע סטיות של בהירות בשל אנאיזוטרופיה של קרינה בתחום הקרוב של הממשק דיאלקטרי.

Protocol

1. זריעה ודגירה של תאים תאי זרע בודד, למשל U373-MG או תאי glioblastoma U-251-MG בצפיפות אופיינית של 100 תאים / מ"מ 2 בשקופית זכוכית ולגדל אותם לשעת 4872 במדיום התרבות (למשל RPMI 1640 בתוספת 10% עגל בסרום עוברי ואנטיביוטיקה) בא…

Discussion

שיטה מתוארת למדידת מרחקי תא מצע בדייקנות ננומטר. נכון להיום, שיטות של מיקרוסקופיה רזולוצית סופר, המבוססות למשל על תאורה מובנית ⁷ או במולקולה בודדה ^8-10 זיהוי, כמו גם ירידה בכמות פליטה מאולצת (STED) מיקרוסקופיה ¹¹ הן בעלות עניין רב. אף אחת מהשיטות הללו,…

Materials

Name	Company	Type	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera