La transfection d'anticorps dans les neurones comme outil pour étudier la pathogenèse des maladies

Summary

Une réponse rapide pour étudier les interactions et les effets sur les mécanismes moléculaires liés à la présence d'anticorps dans un environnement intracellulaire est décrite. Le procédé comprend la transfection d'anticorps dans des cellules vivantes à l'aide d'une formation de complexe non covalent sur la base d'une formulation de lipide. La technique est adaptable à des lignées de cellules immortalisées et des cellules primaires.

Abstract

Anticorps offrir la possibilité d'acquérir un nouvel aperçu de divers événements qui se déroulent dans les systèmes vivants. La capacité à produire des anticorps hautement spécifiques à des protéines cibles a permis de très précis des questions biologiques à traiter. Surtout, les anticorps ont été impliqués dans la pathogenèse de plusieurs maladies humaines, notamment le lupus érythémateux systémique (LES), la polyarthrite rhumatoïde (PR), les syndromes paranéoplasiques, la sclérose en plaques (MS) et humaine de type virus T-lymphotrope 1 (HTLV-1) myélopathie associée / paraparésie spastique tropicale (TSP / HAM) ^1-9. Comment anticorps provoquent la maladie est un domaine de recherche en cours et les données suggèrent que les interactions entre les anticorps et les différentes molécules intracellulaires résultats dans l'inflammation, modifié cellulaire de messagerie, et l'apoptose ^10. Il a été montré que les patients atteints de SEP et TSP / HAM produire des anticorps contre la protéine intracellulaire d'ARN hétérogène protéine de liaison ribonuclear A1 (hnRNP A1) ^{3, 5-7, 9, 11.} Des données récentes indiquent que les anticorps à la fois intra-neuronale et antigènes de surface sont pathogènes ^{3, 5-9, 11.} Ainsi, une procédure qui permet l'étude des anticorps intracellulaire: les interactions entre protéines donnerait une grande perspicacité dans la pathogenèse des maladies.

Les gènes sont souvent transfecté dans des cellules primaires et les lignées cellulaires en culture, mais la transfection d'anticorps dans les cellules a été entravée par la modification de la structure d'anticorps ou de l'efficacité de transfection pauvres ^12. D'autres méthodes de transfection comprennent la transfection d'anticorps à base de liposomes cationiques (composés de DOTAP / DOPE) et polyéthylèneimines (PEI), tous deux ce qui a entraîné une diminution de dix fois dans la transfection d'anticorps par rapport aux témoins ^12. Le procédé mis en oeuvre dans notre étude est similaire à lipide cationique à médiation méthodes et utilise un mécanisme à base de lipides pour former des complexes non covalents avec des anticorps à travers électrostatique et hydrinteractions ophobic ^13. On utilise Ac-DeliverIN réactif, qui est une formulation de lipide capable de capturer des anticorps par des interactions non covalentes électrostatiques et hydrophobes et les délivrer à l'intérieur des cellules. Ainsi, chimiques et génétiques raccords ne sont pas nécessaires pour la livraison des anticorps fonctionnels dans les cellules vivantes. Cette méthode nous a permis d'effectuer des anticorps différents traçage et expériences de localisation de protéines, ainsi que les analyses des conséquences moléculaires de l'anticorps intracellulaire: interactions protéiques ^9.

Dans ce protocole, nous allons montrer comment pour transfecter des anticorps dans les neurones rapide, reproductible et avec un haut degré d'efficacité de la transfection. A titre d'exemple, nous allons utiliser des anticorps anti-hnRNP A1 et anti-IgG. Pour la quantification facile d'efficacité de la transfection, nous avons utilisé des anticorps anti-hnRNP A1 étiquetés avec Atto-550-NHS et marqué au FITC IgG. Atto550 NHS est un nouveau label avec absorption moléculaire élevé et quantique yield. Source d'excitation et des filtres à fluorescence pour Atto550 sont similaires à Cy3 (Ex. 556 Em. 578). En outre, Atto550 a photostabilité élevée. Marqué au FITC IgG ont été utilisés comme contrôle pour montrer que cette méthode est polyvalent et se teignait pas dépendant. Cette approche et les données qui sont générées aidera à comprendre le rôle que les anticorps à des antigènes cibles intracellulaires pourrait jouer dans la pathogenèse des maladies humaines.

Protocol

1. Marquage de l'anticorps (figure 1) Assurez 0,1 M de tampon NaHCO 3: 8,4 g de NaHCO 3 29,2 g de NaCl 1 litre H 2 O Amener le tampon à un pH de 8,4 avec cette solution (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litre H 2 0). Ajouter 35 ul Atto550 NHS à 70 ul anti-hnRNPA1 et 500 pi de tampon NaHCO 3 et tourner pendant 1 heure à température ambiante. Après la …

Discussion

Afin de tester des hypothèses sur des molécules spécifiques et de leur expression, des gènes et d'autres vecteurs sont couramment transfecté dans des cellules. L'aspect unique de cette procédure est la possibilité de facilement transfecter des anticorps dans les cellules cibles. Nous avons effectué cette méthode dans cinq expériences séparées, chacune en double. Résultats d'efficacité de transfection étaient similaires chez toutes les expériences. Surtout, le procédé permet l'entrée d&…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
Fluorescent Microscope AxioObserver A1	Zeiss
Axiovision version 4.2	Zeiss
Anti-rhnRNPA1	Abcam	Ab4791
FITC labeled anti-rIgG	OZ Biosciences	AI20100
Atto550 NHS ester	Sigma	92835
Ab-DeliverIN	OZ Biosciences	AI20100
DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics	Gibco	11320-033
Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides	BD	354632
Multi-Purpose Rotator	Scientific Industries Inc	Model 151
DAPI Mounting Media	Millipore	S7113
PBS	Ambion	9626
Dialyzer	Thermo Fisher Scientific	66380
Amicon Ultra-0.5	Millipore	UFC501096
Paraformaldehyde (4% solution)	Electron Microscopy Sciences
Nano-Drop	Thermo Fisher Scientific