상호 작용과 세포 내 환경에서 항체의 존재에 관한 분자 메커니즘에 미치는 영향을 조사하기 위해 신속하게 접근 방식이 설명되어 있습니다. 방법은 지질 공식에 따라 비 공유 결합 복잡한 형성을 사용하여 라이브 세포에 항체의 transfection을 포함한다. 기술은 불후의 세포 라인과 기본 셀에 적용 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
항체가 생활 시스템에서 일어나는 다양한 이벤트에 소설 통찰력을 얻을 수있는 기능을 제공합니다. 대상 단백질에 매우 구체적인 항체를 생산하는 능력은 해결 될 매우 정확한 생물학적 질문에 사용할 수 있습니다. 중요한 항체는 전신 홍반 루푸스 (SLE), 류마티스 관절염 (RA), paraneoplastic syndromes, 다발성 경화증 (MS)와 인간 T-lymphotropic 바이러스 타입 1 (HTLV-1)를 포함한 인간의 질병의 숫자의 pathogenesis에 연루되어 myelopathy / 열대 경련 paraparesis (햄 / TSP) 1-9 연결된 상태입니다. 항체는 질병이 진행중인 조사의 영역이며, 데이터 항체와 염증의 다양한 세포 내 분자 결과 사이의 상호 작용은 세포 메시징 및 apoptosis 10 변경하는 것이 좋습니다 원인이 방법. 그것은 MS와 햄 / TSP 환자는 세포 내 RNA 결합 단백질 이기종 ribonuclear 단백질에 autoantibodies을 생산하는 것으로 나타되었습니다1월 5일에서 7일까지 (hnRNP A1) 3, 9, 11. 최근 데이터 간 neuronal 및 표면 항원 모두 항체가 병원성 3, 5-9 11아르을 나타냅니다. 따라서, 세포 내 항체의 연구를 위해 할 수있는 절차 : 단백질 상호 작용은 질병 pathogenesis에 큰 통찰력을 부여합니다.
유전자는 일반적으로 기본 세포와 문화에 세포 라인에 transfected 있으며, 세포에 항체의 그러나 transfection이 항체 구조 또는 낮은 transfection 효율을 12 개조에 의해 방해했습니다. transfection의 다른 방법은 양이온 liposomes (DOTAP / 마약으로 구성)과 polyethylenimines (PEI)을 기반으로 항체 transfection을 포함, 컨트롤 12에 비해 항체 transfection의 열 배나 감소로 이어진 둘 다. 우리의 연구에서 수행 한 방법은 양이온 지질로 인한 방법과 유사하고를 통해 항체와 비 공유 결합 복합체를 형성하기 위해 지질 기반 메커니즘을 사용 정전기 및 hydrophobic 상호 작용 13. 우리는 비 공유 결합 정전기와 소수성 상호 작용을 통해 항체를 캡쳐하고 세포 내부를 제공 할 수있는 지질 제제입니다 AB-DeliverIN 시약을 이용. 따라서 화학 및 유전 커플 링은 생활 세포에 기능 항체의 전달에 필요하지 않습니다. 단백질 상호 작용 9 :이 방법은 우리가 다양한 항체는 단백질 현지화 실험뿐만 아니라, 세포 내 항체의 분자 결과의 분석을 추적하고 수행 할 수있게되었습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 빠르게, reproducibly과 transfection 효율의 높은 수준의 뉴런에 항체를 transfect하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, 우리는 반 hnRNP A1 및 안티 IgG 항체를 사용합니다. transfection 효율을 쉽게 정량화를 들어 우리는 아토-550-NHS와 FITC-라벨 IgG으로 표시 방지 hnRNP A1 항체를 사용했습니다. Atto550 NHS는 고분자 흡수 및 양자 순으로 새 레이블연령. 여기 소스와 Atto550에 대한 형광 필터는 Cy3 (예 556 엠. 578)과 비슷합니다. 또한, Atto550 높은 photostability 있습니다. FITC-라벨 IgG는이 방법에 의존 염색 다목적 및 아니라는 것을 보여주기 위해 제어로 사용되었습니다. 이 방법과 생성 된 데이터는 대상 항원을 세포하기 위해 항체 인간 질병의 pathogenesis에서 재생 할 수있는 역할의 이해에 도움이 될 것입니다.
프로토콜
1. 항체 라벨 (그림 1)
- 0.1 M NaHCO 3 버퍼를 만들기 :
- 8.4 g NaHCO 3
- 29.2 g NaCl
- 1리터 H 2 O
- 이 솔루션 (10.6 g 오세영 2 CO 3, 29.2 g NaCl, 1리터 H 2 0)과 8.4의 산도에 버퍼를 가져와.
- 70 μl 방지 hnRNPA1 500 μl NaHCO 3 버퍼 35 μl Atto550 NHS를 추가하고 실온에서 1 시간에 회전 할 수 있습니다. 1 시간 긴 회전 후, dialyzer로 혼합물을 주입하고 하루 아침에 PBS 2 리터에 dialyze.
- 다음 날, 스핀 컬럼 (Amicon 울트라 0.5)를 사용하여 안티 - hnRNPA1 dialyzed Atto550 NHS을 집중.
- Atto550 NHS는 반 hnRNPA1 항체가 집중되어 표시 한 후, 나노 드롭 샘플 농도를 결정합니다.
2. 항체 Transfection (그림 2)
- D....
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토론
특정 분자와 표현에 대한 가설을 테스트하기 위해, 유전자 및 기타 벡터는 일반적으로 세포로 transfected 수 있습니다. 이 절차의 독특한 측면은 쉽게 대상 세포에 항체를 transfect 할 수있는 능력입니다. 우리는 5 개의 실험을 중복의 각이 방법을 수행했습니다. Transfection 효율 결과는 모든 실험들과 비슷했다. 중요한 방법은 항체의 구조 나 기능을 변경하지 않고 셀에 항체의 항목을 수 있습니다. 또한, 라이브 뉴런의 형광 현미경의 사용과 함께, 우리는 일반적으로 55%을 초과 transfection 효율을 확인할 수 있습니다. 즉, 하나의 관심과 세포 내 표적의 항체 사이의 상호 작용에 직접 관련된 가설을 테스트 할 수 있습니다. 이곳에서 공부되지 않았지만, 팹 조각도 활용 될 수있다. 또한, 실험 등 염증성 크린 시토 킨을 추가로 문화 조건을 변경하는 expressi에 영향을 미치는 경우 검토하는 설계 할 수또는 세포 내 타겟의 현지화.
항체는 세포 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 연구 개발의 사무실, 의료 연구 서비스, 보훈학과에서 지원됩니다. 이 연구는 VA 공훈 검토 상 (MCL에)와 테네시 건강 과학 센터 다발성 경화증 연구 기금의 대학 재정 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 형광 현미경 AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision 버전 4.2 | Zeiss | ||
| 안티 rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC 안티 rIgG 표시 | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS 에스테르 | 시그마 | 92,835 | |
| AB-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 10%는 FBS 1%의 항생제 | Gibco | 11320-033 | |
| 폴리-D-라이신 8도 문화 슬라이드 | BD | 354632 | |
| 다중 목적 회전하는 것 | 과학 Industri에스 주식회사 | 모델 151 | |
| DAPI 장착 미디어 | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | 온도 피셔 과학 | 66,380 | |
| Amicon 울트라 - 0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4 % 용액) | 전자 현미경 과학 | ||
| 나노 드롭 | 온도 피셔 과학 |
참고문헌
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A.
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재인쇄 및 허가
