Antilichaam Transfectie in Neuronen als een instrument om de ziekte Pathogenese Studie

Summary

Een snelle benadering van interacties en effecten op moleculaire mechanismen van de aanwezigheid van antilichamen in een intracellulaire omgeving onderzoeken beschreven. De werkwijze omvat transfectie van antilichamen in levende cellen met een niet-covalente complexvorming gebaseerd op een lipide formulering. De techniek is toepasbaar voor geïmmortaliseerde cellijnen en primaire cellen.

Abstract

Antilichamen de mogelijkheid om nieuwe inzicht te krijgen in de verschillende evenementen die plaatsvinden in levende systemen. De mogelijkheid om zeer specifieke antistoffen doeleiwitten is toegestaan ​​voor zeer precieze biologische vragen worden aangepakt. Belangrijker is dat antilichamen betrokken bij de pathogenese van een aantal menselijke ziekten zoals systemische lupus erythematosus (SLE), reumatoïde artritis (RA), paraneoplastische syndromen, multiple sclerose (MS) en menselijk T-lymfotroop virus type 1 (HTLV-1) bijbehorende myelopathie / tropische spastische paraparese (HAM / TSP) ^1-9. Hoe antilichamen veroorzaken ziekte is een gebied van verder onderzoek, en gegevens suggereren dat de interacties tussen antilichamen en verschillende intracellulaire moleculen resulteert in ontsteking, cellulaire messaging en apoptose ¹⁰ veranderd. Het is aangetoond dat patiënten met MS en HAM / TSP auto-antilichamen te produceren voor de intracellulaire RNA bindend eiwit heterogene ribonuclear proteïne A1 (hnRNP A1) ^{3, 5-7, 9, 11.} Recente gegevens wijzen erop dat antilichamen tegen zowel intra-neuronale en oppervlakteantigenen pathogene ^{3, 5-9, 11.} Zo een procedure waarbij voor de studie van intracellulaire antilichamen: eiwit interacties zijn goed inzicht geven in ziekte pathogenese.

Genen worden gewoonlijk getransfecteerd in primaire cellen en cellijnen in cultuur is echter transfectie van antilichamen in cellen gehinderd door verandering van antilichaamstructuur of slechte transfectie-efficiëntie ^12. Andere werkwijzen voor transfectie omvatten antilichaam transfectie gebaseerd op kationische liposomen (bestaande uit DOTAP / DOPE) en polyethyleeniminen (PEI), die resulteerden in een tienvoudige afname in antilichaam transfectie in vergelijking met controles ^12. De werkwijze uitgevoerd in ons onderzoek is vergelijkbaar met kationische lipidegemedieerde werkwijzen en gebruiken van een lipide-gebaseerd mechanisme niet-covalente complexen met de antilichamen door elektrostatische en hydrophobic interacties ^13. We gebruik Ab-DeliverIN reagens, een lipide formulering kan vastleggen antilichamen door niet-covalente elektrostatische en hydrofobe interacties en hen in cellen. Zo chemische en genetische koppelingen zijn niet noodzakelijk voor de levering van functionele antilichamen in levende cellen. Deze methode heeft ons u verschillende antilichaam opsporing en eiwit lokalisatie experimenten, alsmede de analyse van de moleculaire gevolgen van intracellulaire antilichamen: eiwitinteracties ^9.

In dit protocol zullen we zien hoe antilichamen transfecteren tot neuronen snel, reproduceerbaar en met een hoge transfectie-efficiëntie. Als voorbeeld zullen we anti-hnRNP A1 en anti-IgG antilichamen. Voor eenvoudige kwantificering van transfectie efficiency we anti-hnRNP A1 antilichamen gemerkt met Atto-550-NHS en FITC-gelabelde IgG. Atto550 NHS is een nieuw label met een hoog moleculair absorptie en quantum yield. Excitatiebron en fluorescerende filters voor Atto550 zijn vergelijkbaar met Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Bovendien Atto550 een hoge fotostabiliteit. FITC-gelabelde IgG werden gebruikt als controle om aan te tonen dat deze methode is veelzijdig en niet afhankelijk verven. Deze aanpak en de gegevens die gegenereerd zal helpen bij het begrijpen van de rol die antilichamen tegen intracellulaire doelantigenen zouden kunnen spelen in de pathogenese van ziekten.

Protocol

1. Labeling antilichaam (figuur 1) Maak 0,1 M NaHCO3 buffer: 8,4 g NaHCO3 29,2 g NaCl 1 liter H 2 O Breng de buffer tot een pH van 8,4 met deze oplossing (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0). Voeg 35 ul Atto550 NHS tot 70 pi anti-hnRNPA1 en 500 ul buffer NaHCO3 en draaien gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na de een uur durende rotatie, injecteren h…

Discussion

Om hypothesen specifieke moleculen en hun expressie testen worden genen en andere vectoren gewoonlijk getransfecteerd in cellen. Het unieke aspect van deze procedure is de mogelijkheid om eenvoudig antilichamen transfecteren in doelcellen. We hebben deze methode in vijf verschillende experimenten elk in duplo. Transfectie efficiëntie resultaten waren vergelijkbaar voor alle experimenten. Belangrijk is dat de methode kan toegang van antilichamen in de cel zonder dat antilichaam structuur of functie. Verder met het gebru…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
Fluorescent Microscope AxioObserver A1	Zeiss
Axiovision version 4.2	Zeiss
Anti-rhnRNPA1	Abcam	Ab4791
FITC labeled anti-rIgG	OZ Biosciences	AI20100
Atto550 NHS ester	Sigma	92835
Ab-DeliverIN	OZ Biosciences	AI20100
DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics	Gibco	11320-033
Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides	BD	354632
Multi-Purpose Rotator	Scientific Industries Inc	Model 151
DAPI Mounting Media	Millipore	S7113
PBS	Ambion	9626
Dialyzer	Thermo Fisher Scientific	66380
Amicon Ultra-0.5	Millipore	UFC501096
Paraformaldehyde (4% solution)	Electron Microscopy Sciences
Nano-Drop	Thermo Fisher Scientific