Antikropp Transfektion till neuroner som verktyg för att studera sjukdomens patogenes

Summary

En snabb metod för att undersöka interaktioner och effekter på molekylära mekanismer relaterade till närvaron av antikroppar i en intracellulär miljö beskrivs. Metoden innefattar transfektion av antikroppar till levande celler med användning av en icke-kovalent komplexbildning baserad på en lipidformulering. Tekniken är anpassningsbar till immortaliserade cellinjer och primära celler.

Abstract

Antikroppar ger möjlighet att få nya insikter i olika evenemang som äger rum i levande system. Förmågan att producera mycket specifika antikroppar mot målproteiner har gjort för mycket precisa biologiska frågor som måste lösas. Viktigt har antikroppar implicerats i patogenesen av ett antal humana sjukdomar, inklusive systemisk lupus erythematosus (SLE), reumatoid artrit (RA), paraneoplastiska syndrom, multipel skleros (MS) och humant T-lymfotropt virus typ 1 (HTLV-1) tillhörande myelopati / tropiska spastisk parapares (HAM / TSP) ^1-9. Hur antikroppar orsakar sjukdom är ett område med pågående utredning och data antyder att interaktionen mellan antikroppar och olika intracellulära molekyler resulterar i inflammation ändrade cellulära meddelanden och apoptos ^10. Det har visat sig att patienter med MS och skinka / TSP producerar autoantikroppar mot intracellulära RNA-bindande protein heterogen ribonuclear protein A1 (hnRNP A1) ^{3, 5-7, 9, 11.} Nya data tyder på att antikroppar mot både inom neuronala och ytantigener är patogena ^{3, 5-9, 11.} Således ett förfarande som gör det möjligt att studera intracellulära antikropp: skulle proteininteraktioner låna stor insikt i sjukdomens patogenes.

Gener vanligen transfekteras in i primära celler och cellinjer i kultur, har emellertid transfektion av antikroppar i celler har hindrats genom ändring av antikroppsstrukturen eller dålig transfektionseffektivitet ^12. Andra metoder för transfektion innefattar antikroppar transfektion bygger på katjoniska liposomer (bestående av DOTAP / DOPE) och polyetyleniminer (PEI), som båda resulterade i en tio-faldig minskning i antikroppar transfektion jämfört med kontroller ^12. Förfarandet utförs i vår studie liknar katjoniska lipid-medierade metoder och använder en lipid-baserad mekanism för att bilda icke-kovalenta komplex med antikropparna genom elektrostatisk och hydrophobic interaktioner ^13. Vi utnyttjade Ab-DeliverIN reagens, vilket är en lipidberedning kan fånga antikroppar genom icke-kovalenta elektrostatiska och hydrofoba interaktioner och leverera dem inuti celler. Sålunda kemiska och genetiska kopplingar är inte nödvändiga för leverans av funktionella antikroppar i levande celler. Denna metod har gjort det möjligt för oss att utföra olika antikroppar spårning och experiment protein lokalisering, liksom analyser av molekylära konsekvenser intracellulär antikropp: proteininteraktioner ^9.

I detta protokoll kommer vi att visa hur man transfektera antikroppar i nervceller snabbt, reproducerbart och med en hög grad av transfektion effektivitet. Som exempel kommer vi att använda anti-hnRNP A1 och anti-IgG-antikroppar. För enkel kvantifiering av transfektionseffektiviteten vi använt anti-hnRNP A1 antikroppar märkta med Atto-550-NHS och FITC-märkt IgG. Atto550 NHS är en ny etikett med hög molekylär absorption och quantum yiELD. Excitationskälla och fluorescerande filter för Atto550 liknar Cy3 (Mos 556 Em. 578). Dessutom, har Atto550 hög fotostabilitet. FITC-märkt IgG användes som en kontroll för att visa att denna metod är mångsidig och inte färga beroende. Detta tillvägagångssätt och de data som genereras kommer att bidra till förståelsen av den roll som antikroppar mot intracellulära målantigener kan spela i patogenesen av sjukdomar hos människor.

Protocol

1. Antikroppsmärkning (figur 1) Gör 0,1 M NaHCO 3 buffert: 8,4 g NaHCOs 3 29,2 g NaCl 1 liter H-2 O Ta bufferten upp till ett pH av 8,4 med denna lösning (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0). Lägg 35 il Atto550 NHS till 70 pl anti-hnRNPA1 och 500 pl NaHCOa 3 buffert och rotera under 1 timme vid rumstemperatur. Efter den timslånga rotation injicera…

Discussion

För att testa hypoteser om specifika molekyler och deras uttryck, gener och andra vektorer som vanligen transfekteras in i celler. Den unika aspekten av detta förfarande är möjligheten att enkelt transfektera antikroppar i målceller. Vi utförde denna metod i fem separata experiment vardera i dubbletter. Transfektionseffektivitet resultat var liknande bland alla experiment. Viktigt, möjliggör metoden inträde av antikroppar i cellen utan att ändra antikroppar struktur eller funktion. Vidare, med användning av f…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
Fluorescent Microscope AxioObserver A1	Zeiss
Axiovision version 4.2	Zeiss
Anti-rhnRNPA1	Abcam	Ab4791
FITC labeled anti-rIgG	OZ Biosciences	AI20100
Atto550 NHS ester	Sigma	92835
Ab-DeliverIN	OZ Biosciences	AI20100
DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics	Gibco	11320-033
Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides	BD	354632
Multi-Purpose Rotator	Scientific Industries Inc	Model 151
DAPI Mounting Media	Millipore	S7113
PBS	Ambion	9626
Dialyzer	Thermo Fisher Scientific	66380
Amicon Ultra-0.5	Millipore	UFC501096
Paraformaldehyde (4% solution)	Electron Microscopy Sciences
Nano-Drop	Thermo Fisher Scientific