Summary
אנו מתארים שיטות לקביעה
Abstract
סרטן שחלות אפיתל (EOCs) הם הגורם המוביל למוות ממחלה ממארת גינקולוגית בחברות מערביות. למרות התקדמות בטיפול ניתוחי וטיפולי הכימותרפיה משופרים מבוססים-Platinum, חל שיפור קטן בשיעורי הישרדות EOC במשך יותר מארבעה העשורים 1,2. בעוד בשלב I. גידולי בעלי סיכויי הישרדות 5-שנה> 85%, שיעורי הישרדות בשלב III / המחלה הרביעית הם <40%. לפיכך, השיעור הגבוה של תמותה לEOC ניתן היה להפחית באופן משמעותי אם גידולים התגלו בשלבים מוקדמים יותר, הניתנים לטיפול, עוד 3-5. כיום, בסיס הגנטי וביולוגי המולקולרי של התפתחות מחלה בשלב מוקדם הוא הבין היטב. באופן ספציפי יותר, מעט מאוד ידוע על תפקידו של המיקרו במהלך חניכת גידול, אך גורמי סיכון ידועים לEOCs (למשל גיל וזוגיות) מצביעים על כך שmicroenvironment ממלא תפקיד מרכזי בהיווצרות המוקדמת של EOCs. לכן פתחו מודלים תלת ממדיים heterotypicשל שניהם שחלה הנורמלית ושל סרטן שחלות בשלבים מוקדם. לשחלה הנורמלית, אנחנו משטח שיתוף תרבותי נורמלי שחלות אפיתל (יפסיד) ופיברובלסטים נורמלים סטרומה (INOF) תאים, שהונצחו על ידי תמרת retrovrial של המקטע הקטליטית של holoenzyme telomerase האנושי (hTERT) כדי להאריך את תוחלת החיים של תאים אלה בתרבות. למודל בשלבים הראשונים של שינוי שחלות האפיתל תא, ביטוי יתר של אונקוגן CMYC בתאים יפסידו, שוב בשיתוף עם תאים בתרבית-INOF. מודלי heterotypic אלה שמשו כדי לחקור את ההשפעות של הזדקנות והזדקנות על השינוי והפלישה של תאי אפיתל. כאן אנו מתארים את הצעדים מתודולוגיים בפיתוח של אלה מודל תלת ממדי; מתודולוגיות אלה אינן ספציפיות להתפתחות של שחלה נורמלית ורקמות סרטן שחלות, ויכולות לשמש כדי לחקור סוגי רקמות אחרים שבו אינטראקציות תא סטרומה ואפיתל הן בסיסיות היבט של תחזוקת רקמות ודיפיתוח sease.
Protocol
איור 1 מדגים סקירה של תהליך העבודה המתוארת להלן.
1. בידוד של Fibroblasts שחלות הרגילים והארכת תוחלת חיים במבחנה על ידי Overexpression של מקטע קטליטי של Holoenzyme hTERT
- רקמות שחלה ניתן לאסוף בהסכמת מטופל מושכל ואישור של המועצה לביקורת המוסדית (עבור מוסדות בארה"ב). רקמות שחלה רגילות יכולות להיות שנאספו לאחר כריתת רחם כוללת בטן או כריתת רחם לפרוסקופית מוחלטת עם הבילטרלי salpingo-כריתה שחל. במחקר זה, רקמות נבדקו על ידי פתולוג, וחלק מstroma שחלות ביופסיה לתרבית תאים. דגימות רקמה של כ 2-5 מ"מ 2 נקצרו מאזור המרכז של השחלה כדי לנסות להפחית את הסיכוי גם דגימת epithelia שחלות.
- הובלת רקמת השחלה טריה למעבדת תרבית התאים בפיברובלסטים שחלות נורמלים הונצחו (לפיל) מדיום גידול, בתוספת אנטיביוטיקה וantimycotics נוספת. מדיום גידול INOF (INOF-GM) כולל: בינוני 199 וMCDB105 מעורבים ביחס 1:1, בתוספת סרום 15% שור עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, 50 מיקרוגרם / המ"ל גנטמיצין ו250 ng / ml amphotericin B.
- העבודה בתוך ארון בטיחות ביולוגית: הסר את כל תאי האפיתל שיישארו מחובר באופן רופף לרקמות, על ידי שטיפת המדגם עם 5 המ"ל PBS. לשאוב ולחזור פעמים נוספות.
- להעביר את המדגם בתוספת PBS לתוך צלחת תרבות קוטר 10 סנטימטרים נקי (P100). השתמש במלקחיים סטריליות לטיפול ברקמה והמקום למנה שנייה, יבשה P100 נקיית תרבות. השתמש באזמל סטרילי לקצץ 0.5 סנטימטר 2 חתיכות רקמות. הנח כל חתיכה של רקמה לP100 צלחת נפרדת ולחתוך לחתיכות נוספות <1 2 מ"מ בגודל. הוסף 20 מיליליטר INOF-GM (בתוספת אנטיביוטיקה וantimycotics), ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לפקח על גדילת תא באמצעות מיקרוסקופ שלב. תאים ניתן לראות שמירה על שנינות הצלחת 24 שעתי ין.
- Re-הזנה לאחר שבוע, הסרת כל רקמה שאינה חסידה של שאיפה. לאחר מכן, refeed תרבויות פעמים בשבוע. תאים ליצור מושבות, בדרך כלל בתוך 1-3 שבועות. ברגע המושבות הללו הן גדולות מספיק כדי שחבורה (רגע שהם מגיעים סביב 500 מיקרומטר), לבודד את השיבוטים באמצעות דיסקי שיבוט טריפסין מצופים.
אשר תאים הם 100% fibroblastic וללא מזהמים סלולריים אחרים על ידי ציפוי מדגם של שורת תאים על גבי זכוכית וביצוע coverslips מכתים חיסוני פלורסנט סמן fibroblastic (FSP), סמן אפיתל (Pan-cytokeratin) וסמן תא האנדותל (פון Willenbrand הפקטור VIII). - מעבר שחלות פיברובלסטים תא נורמלי עיקרי (נוף) מבודד מP100 מנה אחת ל 3 מנות P100 לפני תמרת retroviral של hTERT יום אחד. מראש עשה-supernatants הנגיפי ניתן לרכוש, או מיוצר בבית תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים לתאי HEK293T שיתוף transfecting-(ראהtarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
supernatants retroviral ניתן להפיק באמצעות pBABE-hygro-hTERT הווקטור (Addgene). הסר NOFs מהחממה ואז לשאוב את מדיום תרבות התא. הוסף 3 מ"ל של supernatant ויראלי לכל מנה: צלחת אחת מקבלת hTERT-רטרווירוס, מנת nd 2 מקבלת GFP-רטרווירוס והמנה 3 מקבלת שום וירוס. כיסוי supernatants הנגיפי עם INOF-GM המכיל polybrene לתת ריכוז סופי של 8 מיקרוגרם / מ"ל. תאים מחדש להאכיל למחרת עם מדיום חדש. ימים לאחר הדבקה, מתחיל בחירה עם מינון נמוך (10 U / ml) hygromycin B. לאחר שבעה ימים ניתן להגדיל מינון זה עד 20 U / ml; בחירה צריכה להיות מלאה בתוך 10-14 ימים. - שיבוטים מבטאים hTERT או GFP יכולים להיות מבודדים על ידי שיבוט טבעת רגע שהם מגיעים סביב 500 מיקרומטר. שורות תאים דורשות אפיון נוסף כדי לאשר את הביטוי המוצלח של hTERT ושימור של תכונות קו תא ראשוניות. זה כרוך: (א)לאשר פעילות telomerase באמצעות PCR-ELISA ואורך הטלומרים, בדרום כתם או PCR 6,7, (ב) המאשר את הביטוי של סמנים קריטיים (למשל immunostaining עם נוגדן אנטי הפאן cytokeratin לזהות תאי אפיתל, ועם אנטי נוגדן פיברובלסטים משטח חלבון לfibroblasts) דומה בין תאים ראשוניים וhTERT הונצחו-; (ג) המאשר את התאים לא מראה מאפיינים של הפיכת גידולים (למשל באמצעות מבחני צמיחה עצמאיים מעגנים): (ד) הארכת אישור של תוחלת חיים במבחנה נצפתה . תאים להביע hTERT אך לא GFP-להביע hTERT fibroblasts שחלות הנורמליות הנציח (INOFs) צריכים לעקוף הזדקנות replicative אך לא neoplastically להשתנות ובנוסף תאי INOF צריכים לשמור על הביטוי של חלבון משטח פיברובלסטים אך לא סמנים האפיתל כגון cytokeratin (איור 2) .
2. ציפוי של תרבות ורקמותמנות E עם PolyHEMA עבור תרבות תא ללא חסיד
- כדי להכין את פתרון polyHEMA, לשקול את polyHEMA 1.5 גרם, ומקום לבקבוק סטרילי. הוסף אתנול 95 מיליליטר ביולוגיה מולקולרי כיתה מוחלטת ומי 5 מיליליטר תא תרבות כיתה מזוקק. הידרוג polyHEMA יתמוסס בתכולת המים של הפתרון, ואתנול לעקר את ההכנה.
- הנח את פתרון polyHEMA בwaterbath על 65 מעלות צלזיוס עד להמסה מלאה. זה עשוי להימשך עד לשעות 8. שים לב שפתרון polyHEMA לא ניתן לאחסן לפרקי זמן ארוכים ולכן תמיד צריך להיות מוכן טרי.
פתרון בעיות: פתרונות של polyHEMA דורשים זמני דגירה ארוכים על 65 ° C. באופן קבוע להפוך את פתרון polyHEMA לערבב. הצמיגות נצפתה בחלק התחתון של בקבוק הזכוכית מציינת polyHEMA אינו מתמוסס באופן מלא ודגירה נוספת על 65 מעלות צלזיוס נדרשה. - עבודה בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית, מנות תרבות רקמות מעיילות עם פתרון polyHEMA. כל sizדואר של צלחת רקמת תרבות, בקבוק או צלחת multiwell יכול להיות מצופה עם polyHEMA. נפחים מומלצים של פתרון polyHEMA הנדרש לכל כלי מוצגים בטבלה 2.
- אפשר מנות תרבות תאים לייבוש בתוך מכסה מנוע הזרימה למינרית. פעולה זו עשויה להימשך 2-3 ימים. נדנדה עדינה על פלטפורמת נדנדה יכולה לשמש כדי להבטיח אפילו ציפוי של מנות גדולות יותר בגודל או צלוחיות. אם מתייבש פתרון polyHEMA מהר מדי את פני השטח לא יכולים להיות חלק. כדי להימנע מכך, להבטיח את המכסה של המנה / בקבוק נשאר על אורך תהליך הייבוש.
- מרח שכבה שנייה של polyHEMA ולאפשר לו להתייבש כמתואר לעיל.
פתרון בעיות: חורים בציפוי polyHEMA יכולים להתרחש, במיוחד כאשר צלחות להתייבש מהר מדי. פעמי ציפוי הצלחות עם polyHEMA מסייעות לכיסוי פערים או סדקים בציפוי מכוסה לפני השימוש. צלחות בדרך כלל לוקחות 2-3 ימים לכל מעייל polyHEMA להתייבש ולכן צריך להיות מוכנות לפחות שבוע לפני שהם יהיו הצורך בתרבית תאים. - צלחות PolyHEMA מצופות ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר עד שימוש.
הערה: פתרוני 1% agarose, מומסים ב1X PBS וautoclaved לעקר, יכולים לשמש גם למאכלים סלולארי תרבות מעייל כדי ליצור משטח שאינו חסיד לculturing 3D לטווח קצר (פחות משבוע). ציפוי agarose של צלחות רבות גם יוצר משטח קעור שמקדם את היווצרות אליפטית יחידה לכל גם לשורות תאים רבות. עם זאת, לתרבויות 3D כבר ציפוי polyHEMA מומלץ כagarose ציפוי לעתים מתפורר לאחר תקופות ארוכות יותר תרבות.
3. תלת ממדי (3D) שהניב spheroids heterotypic מחדש האכלה של תרבויות 3D
- שחזר ולהרחיב תרביות תאי אפיתל INOF ובמבחנה כדי להכין מספיק תאים להקמת שספרואידים heterotypic 3D. ל" תרבויות המוניות "אנחנו בדרך כלל זרעים 2-4x10 6 INOFs לP100 מנה ו0.5-1x10 6 תאי אפיתל לתת סטרומה: ra אפיתלTio של 4:01. תאים גדלים בINOF בינוני INOF צמיחה (INOF-GM) ללא גנטמיצין או amphotericin ב 'אם תרצו, ניתן pretreated תאי פיברובלסטים לפני תרבות 3D (למשל לזירוז הזדקנות, תאים יכולים להיות מטופלים עם מינונים תת קטלניים של מי חמצן ).
- לשטוף צלחת polyHEMA יבשה עם 5 מ"ל בופר פוספט המלוח (PBS) למשך 5 דקות. לשאוב PBS ולהחליף עם 15 המ"ל INOF-GM.
- בינתיים, trypsinize הונצח תאי פיברובלסטים שחלות רגילים לנתק אותם ממנת התרבות, אחרי 3-5 דקות לנטרל את טריפסין עם נפח שווה של התרבות ותקשורת גלולת תאים על ידי צנטריפוגה XG ב 450 למשך 5 דקות.
- השלך את supernatant. צור השעית תא בודד על ידי resuspending התא גלול ב 5 המ"ל INOF-GM, ומערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing בעדינות. קביעת ריכוז תא על ידי ערבוב השעית 10 μl תא ו10 μl trypan כחול וספירה באמצעות hemocytometer. הדרה הכחולה Trypan ניתן להשתמשד לזהות תאים חיים.
- הוסף 6 תאי INOF 4x10 למדיום כבר חלק לצלחת polyHEMA המצופית. הפוך את וליום תרבות התקשורת עד 20 מ"ל באמצעות נפח מתאים של טרי INOF-GM ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תאים מתחילים לצבור לשספרואידים תאיים בתוך 24 שעות. היווצרות אליפטית יכולה להיות פיקוח על ידי מיקרוסקופ שלב.
ספירה מדויקת של מספרי אליפטית בתנאי תרבות המונים היא קשה, אבל אנחנו מעריכים שנקבל 50-100 שספרואידים כאשר 6 תאי 4x10 סטרומה מצופים. גדלי אליפטית בדרך כלל נעים 80-250 מיקרומטר. - מחדש להאכיל את תרבויות אליפטית כל 2-3 ימים על ידי הצבת הצלחות בזווית בפיפטה הממוקמת בתוך מכסה מנוע הזרימה למינרית. אפשר הספרואידים להתיישב. זה עשוי להימשך עד 20 דקות. מוציא בזהירות את התקשורת המותשת עם 5 מ"ל פיפטה, עד שרק כ 4 מ"ל יישאר בצלחת. הקפד לא לשאוב הספרואידים. Re-הזנה עם 16 מ"ל הטרי INOה-F-GM ולחזור לחממה.
- ביום 7, להוסיף תאי האפיתל לשספרואידים פיברובלסטים ליצור תרבויות heterotypic כדלקמן. הכן השעיות של תאי אפיתל שחלות (phenotypically רגיל או שינה) על ידי trypsinization כפי שתואר בסעיף 3.4-3.5. קביעת ריכוז תאים באמצעות hemocytometer. לשטוף פעם בINOF-GM כדי למנוע מגורמי גדילה המתבצע מעל מן תקשורת צמיחת אפיתל.
במעבדה שלנו, משטח שחלות נורמלי שורות תאי אפיתל (OSEC) נאספו בהסכמת מטופל מושכלת משחלות הוסרו על ידי כריתת רחם כוללת בטן או כריתת רחם לפרוסקופית מוחלטת עם הבילטרלי salpingo-כריתה שחל. שחלות היו מוברשות עם cytobrush סטרילי כדי לאסוף את האפיתל. שורות תאים ראשוניות הוקמו וtransduced עם hTERT שימוש בגישה שתוארה לעיל. פרטים של תרבות OSEC ב 2D, 3D והנצחת OSEC ניתן למצוא בהפניות 10 ו 11. - כדי ליצור SPH heterotypiceroids, תרבויות מחדש הזנה הראשונה של שספרואידים פיברובלסטים בלבד. אז לחסן תרבויות פיברובלסטים אליפטית עם 1x10 6 תאי אפיתל ביחס 04:01 פיברובלסטים לתאי אפיתל. תרבות הספרואידים heterotypic בINOF-GM.
- Re-להאכיל תרבויות heterotypic כל 2-3 ימים ל14 ימים נוספים.
4. עיבוד להדמיה וניתוח מולקולרי
- טכניקות שונות יכולות לשמש כדי לנתח הספרואידים heterotypic. עבור הדמיה, מומלץ ששספרואידים נקצרים ממנת התרבות עם פיפטה 25 מ"ל. Pipetting לאט יהיה למזער את הסיכויים של כוחות גזירה לפגוע בארכיטקטורה של אליפטית. Spheroids אז ניתן לכבס בPBS וpelleted ידי עדינות צנטריפוגה XG ב 100 למשך 10 דקות; כוחות צנטריפוגליים גבוהה עלולים לפגוע הספרואידים. לחלופין, תרבויות ניתן להעביר צינור 50 מ"ל בז והרשו להם להתיישב, ואז מדיום הגידול הוסר.
- לimmunohistoכימיה, שספרואידים לתקן עם ניטראלי שנאגרו פורמלין למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. גלולת הספרואידים ולהחליף את הפורמלין עם אתנול 70%. תהליך לפרפין תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים המשמשים לרקמות אנושיות. שספרואידים פרפין מוטבע-יכולים להיות נותחו, ומוכתמים עם או hematoxylin וeosin או סמנים מולקולריים ספציפיים באמצעות אימונוהיסטוכימיה הסטנדרטית (איור 3).
- לחלופין, שספרואידים נשטפו בPBS ניתן לתקן בparaformaldehyde 4% (שהוכן ב PBS), מוטבעים בטמפרטורה בינונית אופטימליים חיתוך אוקטובר והצמד הוקפא לחתך קפוא וכתמי immunofluorescent.
- לניתוחים מולקולריים, הספרואידים ניתן לקצור, pelleted ושטפו פעמים ב PBS לפני lysing תאים לDNA, RNA או מיצוי חלבון.
- לניתוח על ידי cytometry זרימה, שספרואידים ניתן לכבס בPBS וניתק על ידי טריפסין או עיכול accutase ב 37 ° C. כדי לעשות זאת, להטביע את צינור פלקון המכיל שספרואידיםנה waterbath כדי להקל trypsinization. ניתוק מוחלט של שספרואידים לתוך השעית תא בודדה יכול להיות מקודם על ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה עם טיפ 1 מיליליטר פיפטה. היזהר שלא מעל trypsinize התאים.
לנטרל את התגובה עם נפח שווה של מדיום התרבות ולהסיר גושי תאים על ידי העברת ההשעיה דרך מסננת תא מיקרומטר 40-70. תאים גלולים, לשטוף עם PBS, ולמנות resuspend את המספר הרצוי של תאים בחיץ FACS. כתם תאים בהתאם להוראות יצרן.
5. נציג תוצאות
גישה זו יכולה לשמש למגוון רחב של יישומים, ולחקר ביולוגית שחלות נורמלית, כמו גם הלימוד של חניכת סרטן שחלות. יתרון עיקרי של גישה זו על פני תרבויות 3D שנוצרו באמצעות ג'ל מטריקס זמין מסחרי הוא כי fibroblasts השחלות הנורמלים לייצר מטריצה שעושה את up הליבה של הספרואידים. מניסיוננו, מטריקס חומר מיוצר על ידי fibroblasts שחלות הנורמלים הוא הטרוגנית ודומה יותר למטריצה של שחלה מכל ג'ל מטריצה הזמינה מסחרי. במעבדה שלנו יש לנו מנוצלים תאי האפיתל שכבר הפכו באופן חלקי במבחנה באמצעות אלמנטים מוגדרים גנטיים (ביטוי יתר CMYC למשל) ושיתוף בתרבית תאים אלה עם fibroblasts שחלות נורמליות ומזדקן לחקות סרטן שחלות בשלב מוקדם בשחלה בגיל ההבלות. הנתונים שלנו מראים שmicroenvironment ההזדקנות מקדם תכונות neoplastic (ריבוי למשל) של תאי האפיתל שינו באופן חלקי (איור 3), ואילו microenvironment נורמלי מעכב התקדמות נאופלסטית 8. המעבדה ואחרים אף נקט גישות דומות למודל תאים נורמלים שחלות אפיתל 9, תאי אפיתל חצוצרה, מודלי צעד חכם של התקדמות נאופלסטית
איור 1. הסקירה סכמטי של הפרוטוקול עבור culturing heterotypic 3D. צלוחיות תרבית רקמה הם מצופים פעמים עם 1% פתרון polyHEMA ולהתייבש. פלסטיק מצופה PolyHEMA נשטפים עם 1x PBS לפני מייד לשימוש. תאים נורמלים הנציחו שחלות פיברובלסטים (6 תאי 4x10) מצופים לתוך הבקבוק עם מדיום גידול מ"ל 20. היווצרות והצמיחה אליפטית במעקב למשך 7 ימים. בשלב זה, תרבויות אליפטית פיברובלסטים מחוסנות עם 1x10 6 תאי אפיתל, ושני סוגי התאים הם שיתוף תרבית-במשך 14 ימים לפני הספרואידים התאיים נקצרים ומעובד עבור יישומים במורד זרם (ניתוחים מולקולריים, הדמיה, וכו ').
איור 2. מכתים immunofluorescence של hTERT </ Em> הנציח fibroblasts שחלות נורמליות. שני fibroblasts השחלות הנורמלים הראשוני (Pr NOFs) והנציח fibroblasts שחלות הנורמלים (INOFs) חלבון מפורש פיברובלסטים ספציפיים (FSP), אינו מבטא cytokeratin-7 (CK-7) והמפורש vimentin (VIM) . סמנים של עניין מוצגים בירוק, DNA הוא מוכתם בDAPI ומוצג בכחול, הציטופלסמה counterstained עם הכחול ומוצג באדום של האוון.
איור 3. אימונוהיסטוכימיה של תאי סטרומה ואפיתל שיתוף תרבית. פנל שמאלי, monoculture אליפטית פיברובלסטים שחלות הנורמלים, מוכתם על ידי hematoxylin וeosin. תאי פיברובלסטים נורמלים תרבית השחלות לבד בשספרואידים טופס 3D המורכב של תאים בעלי מורפולוגיה המוארכת ומטריקס בשפע. זכות פנל: fibroblasts שחלות הרגילות נחשפו למי חמצן לגרום להזדקנות. תאי אפיתל שחלות שינו באופן חלקי (תפסיד
איור 4. תכונות היסטולוגית של תאים בתרבית 3D משקפות רקמות ראשוניות. () קרצינומות שחלות תא ברורות להציג מבנים אופייניים תא ברורים, אלה נעדרים כאשר קווי EOC תא ברורים גדלים על מבני פלסטיק אך דומים מתגלים כאשר אותם תאים גדלים כשספרואידים 3D ( ב). (ג) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של תאי אפיתל שחלות נורמלים שגודלו כשספרואידים במשך 14 ימים. microvilli Surface גלוי (חיצים). (ד) שספרואידים נסיובי שחלות תאי סרטן הקו, בתרבות. (A, B) ומכתים Hematoxylin eosin של פרפין נותח מוטבע רקמת גידול או שספרואידים 3D; (C) מיקרוסקופיית אלקטרונים; (ד ') שלב מיקרוסקופיה ניגוד. Spheroids יכול להיות כדורי (העיגול מקווקו)או לא סדיר בצורה, כמו במקרה של המבנה נראה בצד השמאלי של התמונה.
| מנה / גודל פלייט | נפח PolyHEMA (שיחול פעמים) | נפח סופי תרבות מדיה |
| צלחת 6-טובה | 3 מ"ל | מ"ל 5-7 |
| צלחת 12-היטב | 1.5 מ"ל | 2 מ"ל |
| צלחת 24 היטב | 500 μl | 1.5 מ"ל |
| צלחת 48-היטב | 250 μl | 500 μl |
| צלחת 96-היטב | 50 μl | 200 μl |
| מנת התרבות P100 | 4-5 מ"ל | 20 מ"ל |
| מנת התרבות P60 | 2-3 מ"ל | מ"ל 5-7 |
| F25 בקבוק | 2-3 מ"ל | 7 מ"ל |
| F75 בקבוק | 4-5 מ"ל | 20-30 מ"ל |
| F175 בקבוק | 15 מ"ל | 30-50 מ"ל |
טבלה 2. מומלץ כרכים עבור ציפוי polyHEMA וculturing 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הביולוגיה של סרטן השחלות האפיתל בשלב מוקדם (EOC) הוא הבין היטב. אולי אחד המכשולים העיקריים בתחום זה במשך שנים רבות היה חוסר הבנה של מקורות הרקמות הספציפיים של המחלה, ושל המשמעות של תפקיד microenvironment בפיתוח EOC. במהלך השנים האחרונות, הוא הפך להיות ברור כי EOC הוא מחלה הטרוגנית עם תת מרובים מובחן histophathological, כנראה עם מקור תאי שונה עבור תת סוגים שונים. לדוגמה, הנתונים הנוכחיים מצביעים על כך שEOCs הרירי בדרגה גבוהה עשויה לנבוע משני תאי שחלת צינור הפרשת האפיתל ותאי אפיתל משטח שחלות; לפחות שיעור EOCs הסלולרי endometrioid והברור הם חשבו שהוא נובע מאנדומטריוזיס שחלות (endometrioma); ו EOCs רירני עשויה לנבוע מparaovarian או אפיתל paratubal מעבר מסוג 15,16. עם זאת, קיימים היו מוגבל רק במבחנה ו<> במודלי vivo של התקדמות מחלה עבור כל histotypes אלה. בדוגמנות heterotypic מבחנה של EOC ללמוד את יחסי גומלין stroma-אפיתל הסרטניים וMicroenvironment קשורים קרצינומות שחלות המתפתחות הוא שטח אפילו פחות מפותח של מחקר. Stroma הגידול עשוי להיות גם מקור של סמנים סרטניים, כמו גם יעד חדש לטיפול. הפיתוח והשימוש במודלים של heterotypic EOC לכן עשוי להיות מפתח לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשניים הקשורים במחלה בשלב מוקדם אשר יכול לשמש כחלק מתכנית של סינון והאיתור המוקדם של מחלה, או לצורך זיהוי של רומן, מטרות טיפוליות druggable כדי לשפר משטרי טיפול לחולים שאובחנו עם EOC.
באופן מהותי יותר, הדגמים שתארנו יכולים לשמש כדי לקבל הבנה עמוקה יותר של שינויים הבסיסיים פנוטיפי ומולקולריים המתרחשים במהלך חניכת EOC ופיתוח המוקדם של מחלה. זה כעת ברור כי תת EOC שונה יש פרופילים שונים מולקולריים, מאפיינים קליניים וביולוגיה בסיסית. על ידי יצירת ספרייה של תאים מבשרים EOC ודוגמנות התפתחותו של כל תת סוג סרטן, כולל השפעות microenvironmental, זה עשוי להיות אפשרי להשיג תובנה חדשות להתפתחות histotypes EOC באמצעות מודלים המשקפים במדויק את התפתחות מחלה במצב האנושי. המתודולוגיות שאנו מתארים יכולות להיות מיושמים על מגוון רחב של מחקרים ויישומים, כוללים מחקר של גידולים מוצקים אחרים. בדקנו את יכולת ההיווצרות אליפטית בלמעלה מ 50 שורות תאי השחלות שונות נורמליות והפכו עד כה, וציינתי כי הרוב המכריע של שורות תאים יכולים להיוצר שספרואידים כאשר מצופים בצפיפות תאים גבוהה על צלחות polyHEMA מצופות. לפיכך, אנו צופים כי מודלי תא תרבות מאיברי יונקים אחרים וגם מינים אחרים יכולים גם להיות מתורבתים ב3D באמצעות גישה זו.
ve_content "> גישות אלה עשויות לייצג מראש במיוחד עבור חקר התפקיד של microenvironment במהלך חניכת גידול, למשל במחקרים של האינטראקציות של סטיות גנטיות סומטיות בדידות בתאי אפיתל סרטניים קיימים במקביל למשתני microenvironmental ספציפיים. הראינו כי שינויים פנוטיפי בתאי סטרומה יכולים להשפיע על הפנוטיפ של תאי אפיתל 8. על ידי שינוי סוגי התאים הנכללים במודל, אפשר לבדוק האם תאי סטרומה שונים באופן דיפרנציאלי להשפיע התפשטות תאי האפיתל וגם ביטוי של סמנים אחרים כגון סמנים ספציפיים הקשורות לפלישה או גרורות. יתר על כן, אלה מודלים יכולים לשמש גם בחקר מחלות שפירות ופיזיולוגית שחלות נורמלית. לדוגמה, מודלי 3D כאלה יכולים לשמש במחקרי פוריות כדי להעריך את תפקידו של stroma השחלות במהלך הבשלת ביצית.ללימוד תרומת המיילcroenvironment לפיתוח EOC והתפקיד של fibroblasts שחלות סרטן הקשורים בEOCs הממאיר, המודלים האלה יכולים גם להיות מותאמים על ידי תאי סרטן שחלות שיתוף עם culturing fibroblasts שבודד מדגימות סרטניות. תרבויות מורכבות יותר יכולות גם להיות שנוצרו על ידי החדרת סוגי תאים נוספים, רלוונטיים למבנה heterotypic. לדוגמה, המודל של אינטראקציות תא סטרומה ואפיתל שפתחנו יכול בתוספת עם ההקדמה של תאים, תאים חיסוניים granulosa או אנדותל. אפשרות נוספת תהיה סוגי שיתוף התרבות אחרים מבשרים סלולריים במודל stroma שחלות, כמו תאי אפיתל מהצינור ורירית רחם השחלה. אפשר גם למודל אינטראקציות paracrine נוספות שהוצעו להיות חשוב במהלך חניכת EOC. לדוגמה, הורמוני סטרואידים יכולים להיות הציגו לתוך מודל heterotypic; או ביטוי של גנים הפועלים paracrine יכול להיות מוטרד באופן בלעדי בתא סטרומה וההשפעה על תאי האפיתל נמדדה.
רוב מקרי סרטן ההשחלות מזוהים בשלב מאוחר, לאחר שהמחלה כבר הופצה באופן נרחב ברחבי הצפק. סרטן השחלות שאובחן כשמקומי לשחלות (שלב 1) ניתן לטפל ביעילות בניתוח ובמעל 90% ממקרי מטופלים נרפאו ממחלתם. ברור כי אסטרטגיות לגילוי מוקדם של סרטן ההשחלות יכולות להפחית באופן משמעותי את התחלואה ותמותה מסרטן השחלות. על ידי הבנה עמוקה יותר של התפתחות מחלה בשלב מוקדם באמצעות גישות דוגמנות organotypic כגון אלו המתוארים כאן, שצפוי שההזדמנויות חדשות לגילוי מחלה באוכלוסיות בסיכון תתגלינה וסופו של דבר מתורגם לפרקטיקה קלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקר זה בוצע בקק הספר לרפואה, אוניברסיטת קליפורניה, ארה"ב, ויוניברסיטי קולג' בלונדון, בריטניה. KL ממומן על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק 5 U19 CA148112-02. BG מומן על ידי מענק מפרויקט צדקת ערב המגבית האונקולוגית הגינקולוגית (בריטניה). חלק מעבודה זו בוצעה בUCLH / UCL היה קצת מימון מהמחלקה לבריאות תכניתו של NIHR Biomedical Research Centre המימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
|||
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
