Summary
Vi beskriver metoder for å etablere
Abstract
Epiteliale eggstokkreft (EOCs) er den ledende dødsårsaken fra gynekologisk kreft i vestlige samfunn. Til tross for fremskritt innen kirurgiske behandlinger og forbedrede platina-baserte chemotherapies, har det vært lite forbedring i EOC overlevelse for mer enn fire tiår 1,2. Mens iscenesette jeg svulster har 5-års overlevelse> 85%, overlevelse for stadium III / IV sykdom er <40%. Dermed kunne de høye dødsrater for EOC bli vesentlig redusert hvis svulster ble oppdaget tidligere, mer treatable, scener 3-5. I dag er det molekylære genetiske og biologiske grunnlaget for tidlig stadium sykdommen utvikling dårlig forstått. Mer spesifikt, er lite kjent om rollen mikromiljøet under startfasen, men kjente risikofaktorer for EOCs (f.eks alder og paritet) tyder på at mikromiljøet spiller en nøkkelrolle i den tidlige dannelsen av EOCs. Vi har derfor utviklet tre-dimensjonale heterotypic modellerav både normale eggstokk og av tidlig fase eggstokkreft. For normal eggstokk, vi co-kultivert normal ovarian overflate epithelial (IOSE) og normal stromal fibroblast (INOF) celler, udødeliggjort av retrovrial transduksjon av den katalytiske subenheten av menneskelig telomerase holoenzyme (hTERT) å forlenge levetiden på disse cellene i kultur. Å modellere de tidligste stadier av eggstokkreft epitelcelleopprinnelse transformasjon, overuttrykte den CMYC onkogen i IOSE celler, igjen co-dyrket med INOF celler. Disse heterotypic modeller ble brukt for å undersøke effektene av aldring og senescence på transformasjon og invasjon av epitelceller. Her beskriver vi de metodiske trinnene i utviklingen av disse tre-dimensjonal modell, og disse metodene er ikke spesifikke for utvikling av normal eggstokk og eggstokkreft vev, og kan brukes til å studere andre vevstyper der stromale og epiteliale celle interaksjoner er et grunnleggende aspekt av vevet vedlikehold og diSease utvikling.
Protocol
Figur 1 viser en oversikt over arbeidsflyten beskrevet nedenfor.
1. Isolering av Normal Ovarian Fibroblaster og utvidelse av in vitro Levetid ved Overuttrykte den katalytiske subenheten av hTERT Holoenzyme
- Eggstokkene vev kan samles med informert pasientens samtykke og godkjennelse av Institutional Review Board (for amerikanske institusjoner). Normal eggstokkene vev kan samles etter total abdominal hysterektomi eller total laparoskopisk hysterektomi med bilateral salpingo-ooforektomi. I denne studien ble vev undersøkt av en patolog og en del av ovarial stroma biopsert for celledyrking. Vevsprøver av ca 2-5 mm 2 ble høstet fra det midtre område av eggstokken å forsøke å redusere sjansen for også prøvetaking ovarian epitel.
- Transportere ferske eggstokkvev til cellekultur laboratorium i udødeliggjort normal ovarian fibroblast (INOF) vekstmedium, supplert med ekstra antibiotika og antimykotika. INOF dyrkningsmedium (INOF-GM) omfatter: Medium 199 og MCDB105 blandet i forholdet 1:1, supplert med 15% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, 50 ug / ml gentamicin og 250 ng / ml amfotericin B.
- Arbeider inne i en biosafety kabinett: Fjern eventuelle epitelceller som forblir løst festet til vevet, ved å vaske prøven med 5 ml PBS. Aspirer og gjenta to ganger til.
- Overfør prøven pluss PBS inn i en ren 10 cm diameter (P100) kultur parabolen. Bruk steril tang til å håndtere vev og sted inn i en andre, tørr P100 ren kultur parabolen. Bruk steril skalpell til å kutte vev 0,5 cm 2 stk. Plasser hver stykke vev i en egen P100 parabol og ytterligere kutt i biter <1 mm 2 i størrelse. Tilsett 20 ml INOF-GM (pluss antibiotika og antimykotika) og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2. Overvåke cellevekst med fase mikroskopi. Celler kan ses å følge parabolen vidd hin 24 hr.
- Re-feed etter en uke, fjerne eventuelle ikke-klebende vev ved aspirasjon. Deretter refeed kulturer to ganger i uken. Celler vil danne kolonier, vanligvis innen 1-3 uker. Når disse koloniene er store nok til å subkultur (når de nå rundt 500 mikrometer), isolere kloner med trypsin-belagte kloning disker.
Bekreft celler er 100% fibroblastic og fri for andre cellulære forurensninger ved plating en prøve av cellelinjen på glassplater dekkglass og utføre immuno-fluorescerende farging for en fibroblastic markør (FSP), en epitelial markør (pan-cytokeratin) og en endotelcelle markør (von Willenbrand Factor VIII). - Passage primære normal ovarian fibroblast (NOF) celle isolater fra en enkelt P100 rett inn tre P100 retter en dag før retroviral transduksjon av hTERT. Pre-laget virus supernatanter kan kjøpes, eller egenprodusert ved hjelp av standard protokoller for co-transfecting HEK293T celler (setarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
Retrovirale supernatanter kan produseres ved hjelp av pBABE-hygro-hTERT vektor (Addgene). Fjern NoFS fra inkubatoren og deretter suge cellekulturmedium. Tilsett 3 ml viral supernatant til hver tallerken: en tallerken får hTERT-retrovirus, mottar 2. parabolen GFP-retrovirus og den tredje antenne mottar ingen virus. Overlappe virale supernatanter med INOF-GM inneholdende polybren å gi en endelig konsentrasjon på 8 ug / ml. Re-feed celler dagen med frisk medium. To dager etter infeksjon, begynner utvalg med lav dose (10 U / ml) hygromycin B. Etter syv dager denne dosen kan økes til 20 U / ml, utvalget bør være fullført innen 10-14 dager. - Kloner som uttrykker hTERT eller GFP kan isoleres ved ring kloning når de når rundt 500 um. Cellelinjer krever ytterligere karakterisering å bekrefte vellykket uttrykk for hTERT og oppbevaring av primære cellelinje funksjoner. Dette innebærer: (a)bekreft telomeraseaktivitet ved PCR-ELISA og telomerlengde, ved Southern blot eller PCR 6,7, (b) bekrefter ekspresjonen av kritiske markører (f.eks farging med et anti-pan-cytokeratin antistoff for å identifisere epitelceller, og med en anti- fibroblast overflateprotein antistoff for fibroblaster) er lik mellom primære og hTERT-udødeliggjort celler, (c) som bekrefter cellene ikke viser egenskapene neoplastisk transformasjon (ved bruk av f.eks anchorage uavhengige vekst assays), (d) som bekrefter forlengelse av in vitro levetid observert i . cellene uttrykker hTERT men ikke GFP hTERT-uttrykkende udødeliggjort normale ovarian fibroblaster (INOFs) bør omgå replikative senescence men ikke være neoplastically transformert; tillegg den INOF celler bør opprettholde ekspresjon av fibroblast overflateprotein men ikke epiteliale markører som cytokeratin (figur 2) .
2. Belegg av Tissue Culture Retter med PolyHEMA for Non-tilhenger Cell Culture
- Å forberede polyHEMA løsning, veier ut 1,5 g polyHEMA, og plasser i en steril flaske. Legg 95 ml molekylærbiologi grade absolutt etanol og 5 ml cellekultur grade destillert vann. Den polyHEMA hydrogelen vil oppløses i vanninnholdet av løsningen, og etanolen vil sterilisere preparatet.
- Plasser polyHEMA løsningen i et vannbad ved 65 ° C inntil fullstendig oppløst. Dette kan ta opp til 8 timer. Legg merke til at polyHEMA løsningen ikke kan lagres over lengre tid, og så skal alltid være forberedt frisk.
PROBLEMER: Løsninger av polyHEMA krever lange inkubasjonstider ved 65 ° C. Regelmessig invertere polyHEMA løsning å blande. Viskositet observert ved bunnen av glassflaske indikerer polyHEMA er ikke fullt oppløst og ytterligere inkubasjon ved 65 ° C nødvendig. - Arbeider inne i en laminær hette, pels vev kultur retter med polyHEMA løsningen. Enhver size av vev kultur parabol, kolbe eller multiwell plate kan være belagt med polyHEMA. Anbefales mengder polyHEMA løsning kreves for hvert fartøy er angitt i tabell 2.
- Tillat cellekultur oppvasken tørke inne i laminær strømning hette. Dette kan ta 2-3 dager. Milde rocking på en gyngende plattform kan brukes for å sikre jevnt belegg av større størrelse retter eller flakonger. Dersom polyHEMA løsningen tørker for fort overflaten ikke kan være glatt. For å unngå dette, må du sørge lokket på parabolen / kolben forblir på hele tørkeprosessen.
- Påfør et strøk polyHEMA og la den tørke som beskrevet ovenfor.
PROBLEMER: Hull i polyHEMA belegg kan oppstå, spesielt når platene tørker for raskt. Double-belegge platene med polyHEMA bidrar til å dekke hull eller sprekker i belegget er dekket før bruk. Platene tar vanligvis 2-3 dager for hver polyHEMA strøk tørke og så bør være forberedt på minst en uke før de vil være behov for cellekultur. - PolyHEMA-belagte plater kan oppbevares ved romtemperatur før bruk.
MERK: 1% agarose-løsninger, oppløst i 1X PBS og autoklaveres for å sterilisere, kan også brukes til å belegge cellekultur retter å lage en ikke-klebende overflate for kortsiktig 3D dyrking (mindre enn en uke). Agarose belegg av multi-brønn plater skaper en konkav overflate som fremmer dannelse av en enkelt sfæroide per brønn for mange cellelinjer. Men for lengre 3D kulturer polyHEMA belegg anbefales som agarose belegg ofte går i oppløsning etter lengre kultur perioder.
3. Generere tredimensjonale (3D) Heterotypic sfæroider og Re-fôring av 3D kulturer
- Gjenopprette og utvide INOF og epiteliale cellekulturer in vitro for å forberede nok celler for å etablere 3D heterotypic sfæroider. For 'masse kulturers vi vanligvis frø 2-4x10 6 INOFs per P100 parabol og 0,5-1x10 6 epitelceller å gi en stromal: epitelial ratio på 4:1. INOF celler dyrkes i INOF dyrkningsmedium (INOF-GM) uten gentamicin eller amfotericin B. Om ønsket kan fibroblastceller være forbehandlet før 3D kultur (f.eks for induksjon av senescence, kan cellene bli behandlet med subletale doser av hydrogenperoksyd ).
- Vask en tørr polyHEMA plate med 5 ml fosfatbufret saltvann (PBS) i 5 min. Aspirer PBS og erstatte med 15 ml INOF-GM.
- Mellomtiden trypsinize udødeliggjort normale ovarian fibroblastceller å løsrive dem fra kultur parabol, etter 3-5 min nøytralisere trypsin med et likt volum av kulturmedium og pellet cellene ved sentrifugering ved 450 xg i 5 minutter.
- Kast supernatanten. Lag en encellet suspensjon av oppslemme cellepelleten i 5 ml INOF-GM, bland godt med pipettering opp og ned eller virvling forsiktig. Bestem cellekonsentrasjon ved blanding 10 ul cellesuspensjon og 10 ul Trypan blå og opplisting bruke en hemocytometer. Trypan blå utelukkelse kan bruked å identifisere levende celler.
- Legg 4x10 6 INOF celler til mediet allerede utlevert i polyHEMA-belagt plate. Gjøre opp kulturen medievolumet til 20 ml ved hjelp av et egnet volum av fersk INOF-GM og inkuber ved 37 ° C, 5% CO 2. Cellene begynner å aggregere i flercellede sfæroider innen 24 hr. Sfæroide dannelse kan bli overvåket av fase mikroskopi.
Nøyaktig telling av sfæroide numre under massekulturen forhold er vanskelig, men vi regner med at vi får 50-100 sfæroider når 4x10 6 stromaceller er belagt. Sfæroide størrelser vanligvis varierer 80-250 mikrometer. - Re-mate sfæroide kulturer hver 2-3 dager ved å hvile platene i en vinkel på en pipette plassert innenfor det laminære strømningshette. Tillat sfæroider å bosette seg. Dette kan ta opptil 20 min. Fjern forsiktig de utslitte media med en 5 ml pipette, til bare ca 4 ml igjen i parabolen. Pass på å ikke suge på sfæroider. Re-feed med 16 ml fersk INOF-GM og gå tilbake til inkubatoren.
- På dag 7, legge epitelceller til fibroblast sfæroider opprette heterotypic kulturer som følger. Forbered suspensjoner av eggstokkreft epitelceller (fenotypisk normal eller transformert) ved trypsinisering som beskrevet i kapittel 3.4 til 3.5. Bestem cellekonsentrasjonen ved hjelp av en hemocytometer. Vask en gang i INOF-GM for å hindre eventuelle vekstfaktorer blir overført fra epiteliale vekstmedier.
I vårt laboratorium, normal ovarian overflate epiteliale celler (OSEC) linjer ble samlet med informert pasientens samtykke fra eggstokkene fjernet av total abdominal hysterektomi eller total laparoskopisk hysterektomi med bilateral salpingo-ooforektomi. Eggstokkene ble børstet med en steril cytobrush å samle epitel. Primære cellelinjer ble etablert og transduced med hTERT bruke tilnærmingen beskrevet ovenfor. Detaljer om OSEC kultur i 2D, kan 3D og OSEC immortalization bli funnet i referanser 10 og 11. - For å danne heterotypic spheroids, første re-feed kulturer av fibroblast sfæroider alene. Deretter inokuler fibroblast sfæroide kulturer med 1x10 6 epitelceller i forholdet 04:01 fibroblaster til epitelceller. Kultur de heterotypic sfæroider i INOF-GM.
- Re-feed heterotypic kulturer hver 2-3 dager for ytterligere 14 dager.
4. Prosessering for Imaging og molekylær Analyser
- Mange forskjellige teknikker kan brukes til å analysere heterotypic sfæroider. For bildebehandling, anbefales det at sfæroider høstes fra kulturen parabolen med en 25 ml pipette. Pipettering sakte vil minimere sjansene for skjærkrefter forstyrre arkitekturen av den sfæroide. Sfæroider kan deretter vasket i PBS og pelletert ved forsiktig sentrifugering ved 100 xg i 10 min, høyere sentrifugalkrefter kan skade sfæroider. Alternativt, kan kulturer bli overført til en 50 ml falk røret og tillates å sedimentere, og vekstmediet deretter fjernet.
- For immunohistokjemi, fikse sfæroider med nøytral bufret formalin i 30 minutter ved romtemperatur. Pellet de sfæroider og erstatte formalin med 70% etanol. Prosessen i parafin ved hjelp av standard protokoller som brukes for menneskelig vev. Parafin-embedded sfæroider kan være seksjonert, og farget med enten hematoxylin og eosin eller bestemte molekylære markører ved hjelp av standard immunhistokjemi (figur 3).
- Alternativt kan sfæroider vasket i PBS bli fiksert i 4% paraformaldehyd (utarbeidet i PBS), forankret i Optimal Cutting Temperatur oktober medium og snap frosset for frosne seksjonering og immunofluorescent flekker.
- For molekylære analyser, kan sfæroider høstes, pelletert og vasket to ganger i PBS før lysering celler for DNA, RNA eller protein utvinning.
- For analyse ved strømningscytometri, kan sfæroider vaskes i PBS og dissosiert ved trypsin eller accutase fordøyelsen ved 37 ° C. For å gjøre dette, senk Falcon rør som inneholder sfæroider jegna vannbad for å lette trypsinisering. Komplett dissosiasjon av sfæroider i en enkelt celle suspensjon kan fremmes ved pipettering løsningen opp og ned med en 1 ml pipette tips. Pass på ikke å over-trypsinize cellene.
Nøytraliser reaksjonsblandingen med et likt volum av dyrkingsmedium og fjerne celle klumper ved å føre suspensjonen gjennom et 40-70 um celle sil. Pellet celler, vask med PBS, spesifisere og resuspender ønsket antall celler i FACS-buffer. Stain celler i henhold til produsentens instruksjoner.
5. Representant Resultater
Denne tilnærmingen kan brukes for et bredt spekter av applikasjoner, og for studier av normale ovarial biologi samt studiet av eggstokkreft initiering. En stor fordel med denne tilnærming over 3D kulturer opprettet med kommersielt tilgjengelig ekstracellulær matriks gel er at de normale ovarian fibroblaster produsere ekstracellulær matriks som gjør up kjernen av sfæroider. I vår erfaring, er grunnmassematerialet produsert av normal ovarian fibroblaster heterogene og mer ligner den ekstracellulære matrise av eggstokken enn noen kommersielt tilgjengelig matrise gel. I vårt laboratorium har vi utnyttet epitelceller som har blitt delvis forvandlet in vitro hjelp av definerte genetiske elementer (f.eks CMYC overexpression) og co-kulturperler disse cellene med normale og senescent eggstokkene fibroblaster å etterligne tidlig stadium eggstokkreft i en post-menopausal eggstokk. Våre data antyder at den aldrende mikromiljøet fremmer neoplastiske funksjoner (f.eks spredning) av delvis transformerte epitelceller (figur 3), mens en normal mikromiljø hemmer neoplastisk progresjon 8. Vår lab og andre har også brukt lignende metoder for å modellere normale eggstokkene epitelceller 9, egglederen epitelceller, trinnvis modeller av neoplastisk progresjon
Figur 1. Skjematisk oversikt over protokollen for 3D heterotypic dyrking. Cellekulturstudier flasks er dobbelt belagt med en 1% polyHEMA løsning og lov til å tørke. PolyHEMA belagte plast vaskes med 1x PBS umiddelbart før bruk. Udødeliggjort normale ovarian fibroblastceller (4x10 6 celler) er belagt i kolben med 20 ml vekstmedium. Spheroid dannelse og vekst overvåkes over 7 dager. På dette punktet, er fibroblast sfæroide kulturer inokulert med 1x10 6 epitelceller, og de to celletypene er co-dyrket i 14 dager før de flercellede sfæroider høstes og bearbeides for nedstrøms applikasjoner (molekylære analyser, bildebehandling, osv.).
Figur 2. Immunfluorescens farging av hTERT </ Em> udødeliggjort normale eggstokkene fibroblaster. Begge primære normale eggstokkene fibroblaster (Pr NoFS) og foreviget normale eggstokkene fibroblaster (INOFs) uttrykker fibroblast spesifikk protein (FSP), uttrykker ikke cytokeratin-7 (Ck-7) og uttrykke vimentin (VIM) . Markører av interesse vises i grønt, er DNA farget med DAPI og vist i blått, er cytoplasma kontrafarget med Evan blå og vist i rødt.
Figur 3. Immunhistokjemi av co-kulturperler stromale og epiteliale celler. Venstre panel, normal ovarian fibroblast spheroid monokultur, farget av hematoxylin og eosin. Normale eggstokkene fibroblastceller dyrket alene i 3D-form sfæroider består av celler med en spindled-morfologi og rikelig ekstracellulær matrix. Høyre panel: normal ovarian fibroblaster ble utsatt for hydrogen peroxide å indusere senescence. Delvis forvandlet eggstokkene epitelceller (IOSE
Figur 4. Histologiske trekk ved 3D dyrkede celler reflekterer primære vev. (A) klarcellet eggstokkene karsinomer vise karakteristiske klare cellestrukturer, disse er fraværende når klarcellet EOC linjer dyrkes på plast, men lignende strukturer blir oppdaget når de samme cellene dyrkes som 3D sfæroider ( B). (C) Scanning elektron micrograph av normale eggstokkene epitelceller dyrket som sfæroider i 14 dager. Surface microvilli er synlige (piler). (D) Serous eggstokkreft cellelinje sfæroider, i kultur. (A, B) Hematoxylin og eosin farging av seksjonert parafin innebygd svulstvev eller 3D sfæroider, (C) scanning elektronmikroskopi, (D) fasekontrast mikroskopi. Sfæroider kan være sfærisk (stiplet sirkel)eller irregulær form, som i tilfellet av strukturen sees på venstre side av bildet.
| Fat / Tallerkener Size | Volum av PolyHEMA (som skal anvendes to ganger) | Kultur Media sluttvolum |
| 6-brønns plate | 3 ml | 5-7 ml |
| 12-brønns plate | 1,5 ml | 2 ml |
| 24-brønns plate | 500 ul | 1,5 ml |
| 48-brønns plate | 250 pl | 500 ul |
| 96-brønns plate | 50 ul | 200fil |
| P100 kultur tallerken | 4-5 ml | 20 ml |
| P60 kultur tallerken | 2-3 ml | 5-7 ml |
| F25 kolbe | 2-3 ml | 7 ml |
| F75 kolbe | 4-5 ml | 20-30 ml |
| F175 kolbe | 15 ml | 30-50 ml |
Tabell 2. Anbefalt volumer for polyHEMA belegg og 3D dyrkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biologi tidlig stadium ovarialcancer (EOC) er dårlig forstått. Kanskje en av de viktigste hindringer i dette feltet i mange år har vært mangel på forståelse av vev konkrete opprinnelsen til sykdommen, og av betydningen av den rollen mikromiljøet i EOC utvikling. I løpet av de siste årene, har er blitt klart at EOC er en heterogen sykdom med flere forskjellige histophathological undergrupper, sannsynligvis med ulike cellulære opprinnelse for ulike undergrupper. For eksempel, dagens data tyder på at høy grad serøs EOCs kan stamme fra begge egglederen sekretoriske epitelceller og eggstokkreft overflate epitelceller, minst en andel av endometrioid og klare celle EOCs antas å oppstå fra eggstokkene endometriose (endometrioma), og mucinous EOCs kan oppstå fra paraovarian eller paratubal overgangsordning-type epitel 15,16. Imidlertid har det vært bare begrenset i vitro og <em> in vivo modeller av sykdom progresjon for noen av disse histotypes. In vitro heterotypic modellering av EOC å studere tumor stroma-epiteliale interaksjoner og mikromiljøet forbundet med å utvikle ovarian karsinomer er en enda mindre utbygd område av forskning. Svulsten stroma er sannsynlig å være både en kilde av tumor biomarkører samt en roman mål for terapi. Utviklingen og bruken av heterotypic modeller av EOC kan derfor være nøkkelen til identifisere nye biomarkører forbundet med tidlig stadium sykdom som kunne brukes som en del av et program for screening og tidlig påvisning sykdom, eller for identifisering av nye, til druggable terapeutiske mål forbedre behandlingsregimer for pasienter med diagnosen EOC.
Mer fundamentalt, kan modellene vi har beskrevet brukes for å få en dypere forståelse av de underliggende fenotypiske og molekylære endringer som oppstår under EOC initiering og tidlig sykdomsutvikling. Det er nå klart at ulike EOC subtyper har forskjellige molekylære profiler, kliniske egenskaper og underliggende biologi. Ved å generere et bibliotek av EOC forløper celler og modellere utviklingen av hver kreft subtype, inkludert microenvironmental påvirkninger, kan det være mulig å få ny innsikt inn i utviklingen av EOC histotypes gjennom modeller som nøyaktig reflekterer sykdomsutvikling i menneskelige tilstand. De metoder vi beskriver kan brukes til et bredt spekter av studier og programmer, inkludert studier av andre solide svulster. Vi har testet spheroid formasjon evne i over femti forskjellige normal og forvandlet eggstokkene cellelinjer til dags dato, og observert at det store flertallet av cellelinjer er i stand til å danne sfæroider når belagt med høy celletetthet på polyHEMA-belagte plater. Vi derfor forventer at cellekultur modeller fra andre pattedyr organer og også andre arter kan også dyrkes i 3D ved hjelp av denne tilnærmingen.
ve_content "> Disse metodene kan representere et forskudd spesielt for å studere rollen til mikromiljøet under startfasen, for eksempel i studier av interaksjoner av diskrete somatiske genetiske avvik i tumor epitelceller eksisterende samtidig med spesifikke microenvironmental variabler. Vi har vist at fenotypiske endringer i stromaceller kan påvirke epitelcelleopprinnelse fenotype 8. Ved å endre celletypene inngår i modellen, kunne en undersøke om forskjellige stromaceller differensielt påvirke epitelisk celleproliferasjon og også ekspresjonen av andre spesifikke markører f.eks markører assosiert med invasjon eller metastase. Dessuten, disse modeller kan også bli brukt i studiet av benign sykdom og normal ovarial fysiologi. For eksempel kan slike 3D modeller brukes fertilitetsstudier å vurdere rollen ovarian stroma under oocytten modning.For å studere bidraget fra microenvironment til EOC utvikling og rolle eggstokkreft-tilknyttede fibroblaster i maligne EOCs, kan disse modellene også tilpasses av co-dyrking eggstokkreft celler med fibroblaster isolert fra vevsprøver. Mer komplekse kulturer kunne også bli generert ved å innføre flere relevante celletyper i heterotypic strukturen. For eksempel kan modellen av stromale og epiteliale celle interaksjoner vi utviklet av supplert med innføringen av granulosa celler, immun eller endotelceller. En annen mulighet ville være å co-KULTUR forløperforbindelser celletyper i ovarial stroma modellen, slik som epitelceller fra egglederen og endometrium. Det er også mulig å modellere flere parakrine interaksjoner som er foreslått å være viktig i EOC initiering. For eksempel, kan steroidhormoner innføres i heterotypic modellen, eller ekspresjon av parakrine virkende genene kunne perturbert utelukkende i stromal kammeret ogeffekten på epitelceller målt.
Flertallet av eggstokkreft er identifisert på et sent stadium, etter at sykdommen har spredt vidt gjennom peritoneum. Eggstokkreft diagnostisert når lokalisert til eggstokkene (trinn 1) kan effektivt behandles med kirurgi og i over 90% av tilfellene pasientene blir friske av sykdommen. Det er klart at strategier for tidligere deteksjon av eggstokkreft kan redusere eggstokkreft sykelighet og dødelighet. Ved å få en dypere forståelse av tidlig stadium sykdommen utvikling ved hjelp organotypic modellering tilnærminger som beskrevet her, er det forventet at nye muligheter for sykdom deteksjon i utsatte befolkningsgrupper vil bli avslørt og til slutt oversatt til klinisk praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne forskningen ble utført ved Keck School of Medicine, University of California, USA, og University College London, UK. KL er finansiert av National Institute of Health tilskudd 5 U19 CA148112-02. BG ble finansiert av et prosjekt stipend fra Eve Appeal gynekologisk onkologi veldedighet (UK). Noe av dette arbeidet utføres på UCLH / UCL ble delvis finansiering fra Department of Health NIHR Biomedical Research Centre støtteordning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyHEMA, suitable for cell culture | Sigma Aldrich | P3932 | |
| Molecular biology grade ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Sterile water for cell culture | VWR | 12001-356 | |
| MCDB105 | Sigma Aldrich | M6395 | |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | |
| Hyclone Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30088.03 | |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1397 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| pBABE-hygro-hTERT | Addgene | 1773 | |
| PBS | VWR | 12001-766 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-072 | |
| Cell strainer (40 or 70μm) | VWR | 21008-949 21008-952 |
|
| Anti-fibroblast surface protein antibody, clone 1B10 | Sigma | F4771 | |
| Anti-pan-cytokeratin antibody (C11) | Santa Cruz | sc-8018 | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | 107689 | |
| TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAPLUS | Roche | 12013789001 | |
| TeloTAGGG Telomere Length Assay | Roche | 12209136001 | |
Table 1. Reagents and Equipment Referred to in this study. |
|||
References
- Jelovac, D., Armstrong, D. K. Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer. CA Cancer J. Clin. , (2011).
- Office for National Statistics. Cancer Statistics registrations: registrations of cancer diagnosed in 2008. , England. (2011).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Santos, J. L. Tumor type and substage predict survival in stage I and II ovarian carcinoma: insights and implications. Gynecol. Oncol. 116, 50-56 (2010).
- Köbel, M., Kalloger, S. E., Boyd, N. Ovarian carcinoma subtypes are different diseases: implications for biomarker studies. PLoS Med. 5, e232 (2008).
- Smith, L. H., Morris, C. R., Yasmeen, S. Ovarian cancer: can we make the clinical diagnosis earlier. Cancer. 104, 1398-1407 (2005).
- Aviv, A., Hunt, S. C., Lin, J., Cao, X., Kimura, M., Blackburn, E. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length/DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res. 39, e134 (2011).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP. Nucleic Acids Res. 25, 2595-2597 (1997).
- Lawrenson, K., Grun, B., Benjamin, E. Senescent fibroblasts promote neoplastic transformation of partially transformed ovarian epithelial cells in a three-dimensional model of early stage ovarian cancer. Neoplasia. 12, 317-325 (2010).
- Lawrenson, K., Benjamin, E., Turmaine, M. In vitro three-dimensional modelling of human ovarian surface epithelial cells. Cell Prolif. 42, 385-393 (2009).
- Lawrenson, K., Sproul, D., Grun, B. Modelling genetic and clinical heterogeneity in epithelial ovarian cancers. Carcinogenesis. 32, 1540-1549 (2011).
- Grun, B., Benjamin, E., Sinclair, J. Three-dimensional in vitro cell biology models of ovarian and endometrial cancer. Cell Prolif. 42, 219-228 (2009).
- Zietarska, M., Maugard, C. M., Filali-Mouhim, A., Alam-Fahmy, M., Tonin, P. N., Provencher, D. M., Mes-Masson, A. M. Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC. Mol. Carcinog. 46, 872-885 (2007).
- Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology. Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).
- Dafou, D., Grun, B., Sinclair, J. Microcell-mediated chromosome transfer identifies EPB41L3 as a functional suppressor of epithelial ovarian cancers. Neoplasia. 12, 579-589 (2010).
- Levanon, K., Crum, C., Drapkin, R. New insights into the pathogenesis of serous ovarian cancer and its clinical impact. J. Clin. Oncol. 26, 5284-5293 (2008).
- Kurman, R. J., Shih, I. eM. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum. Pathol. 42, 918-931 (2011).
