Summary
우리는 단일 분자 형광 이미징을위한 최소화 유체 역학적 크기 콜로이드 양자 점의 준비에 대해 설명합니다. 기존의 양자 점에 비해,이 나노 입자는 구형 단백질의 크기와 비슷합니다 및 단일 분자 밝기, photodegradation에 대한 안정성 및 단백질과 세포에 특이 현상 바인딩에 대한 저항에 최적화되어 있습니다.
Abstract
단일 분자 이미징은 biomolecular 기능의 메커니즘을 이해하고 세포 생물학 1-4 기초 분자 행동의 공간과 시간적 이질성을 시각화를위한 중요한 도구입니다. 이미지의 관심 개별 분자를로, 일반적으로 형광 태그 (염료, 단백질, 구슬, 또는 양자 점)에 복합 및 epifluorescence 또는 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경으로 관찰합니다. 염료와 형광 단백질 수십 년 동안 형광 이미징의 의지가되는 것되었습니다 있지만, 자신의 형광 신호의 전체 손실되기 전에 관찰 몇 초 만에 항복, 개별 분자를 관찰 할 필요가 높은 광자 fluxes에서 불안정합니다. 라텍스 구슬 및 염료 표시된 구슬은 개선 신호 안정성을 제공하지만, deleteriously 연구 아래에있는 분자의 확산과 동작을 변경할 수 있습니다 획기적으로 큰 유체 역학적 크기의 비용.
ntent는 "> 양자 점 (QDs)은이 두 문제가 정권 사이의 균형을 제공합니다.이 나노 입자는 반도체 재료로 구성되어 있으며 photodegradation 5 뛰어난 저항과 hydrodynamically 소형 크기 설계 할 수 있습니다. 따라서 최근 몇 년 동안 QDs 사용 설정에 역할을되었습니다 단일 분자 수준에서 복잡한 macromolecular 문제의 장기 관찰. 그러나 이러한 입자는 여전히 이러한 자신의 크기가 여전히 4,6 너무 큰 세포 세포질과 분열 neuronal 신경 등 사람들이 많은 분자 환경에서 장애 확산을 전시 할 수 발견되었습니다 , 7.콜로이드 안정성, photostability, 밝기, 그리고 과거 8,9에 소형 QDs의 유틸리티를 방해 한 특이 현상 바인딩 오프셋을 균형하면서 최근 우리는 코어와 최소화 유체 역학적 크기 QDs의 표면 코팅을 설계했습니다. 이 문서의 목적은 입증하는 것입니다절연 카드뮴 Y 아연 1 Y S 쉘, 짧은 폴리에틸렌 글리콜과 수정 multidentate 고분자 리간드들과의 코팅 (코팅 합금 HG X CD 1-X 놈들이 코어 구성이 최적화 된 nanocrystals의 합성, 수정, 및 특성, PEG) 체인 (그림 1). 기존의 CdSe의 nanocrystals에 비해, HG X CD 1-X 놈들이 합금은 강화 된 세포의 신호 대 노이즈 비 세포 독성 눈에 보이는 파장의 여기에 붉은 색과 가까운 적외선 파장에서 형광, 형광의 큰 양자 수율을 제공합니다. Multidentate 폴리머 코팅 유체 역학적 크기를 최소화하기 위해 폐쇄와 평면 형태의 nanocrystal의 표면에 바인딩, 그리고 PEG는 세포와 분자에 특이 현상 바인딩을 최소화하기 위해 표면 전하를 중화. 최종 결과는 550-800 nm의 12 나노 미터 근처에있는 총 유체 역학적 크기 사이의 방출과 밝은 형광 nanocrystal입니다. 이들에많은 수용성 구형 세포의 단백질, 그리고 기존의 PEGylated QDs (25-35 nm 정도)보다 실질적으로 더 작은으로 보자 크기까지 다양합니다.
Protocol
다음 합성 절차는 표준 공기 무료 기술과 진공 / 불활성 가스 매니 폴드의 사용을 포함, 자세한 방법론은 참조 10 호와 11 호에서 찾을 수 있습니다. 모든 잠재적 인 독성 및 가연성 물질에 대한 MSDS는 사용하기 전에 조언을해야하고 모든 가연성 및 / 또는 공기 불안정한 화합물은 글러브 박스 나 장갑 가방에 심장 - 밀봉 된 병에 aliquoted해야합니다.
1. 머큐리 카드뮴 셀렌의 합성 (HG X CD 1-X SE) 양자 도트 코어
- trioctylphosphine (TOP)에서 셀레늄의 0.4 M 솔루션을 준비합니다. 50 ML 3 목 플라스크에 셀레늄 (0.316 g, 4 mmol)을 추가 한 다음 벗어나 아르곤은 Schlenk 라인을 사용하여 입력합니다. 공기가없는 상황에서 (건조 질소 또는 아르곤 분위기), 100-10 ML의 TOP와 열을 추가 ° C 명확한, 무색의 솔루션을 창출하고 1 시간에 감동하면서. 실내 온도에 솔루션을 시원하고 옆 술병을 설정합니다.
- 250 ML 3 목 플라스크에, 카드뮴 산화물을 추가 (CDO 0.0770 g, 0.6 mmol), tetradecylphosphonic 산 (TDPA, 0.3674 g, 1.32 mmol) 및 octadecene (ODE, 27.6 ML)를 교반하면서 Schlenk 줄을 사용 솔루션을 피난한다. 100 ° C로 온도를 높이고 저비점 불순물을 제거하는 추가 15 분에 피난한다.
- 아르곤 또는 질소 가스에서 완전히 CDO를 해산하기 위해 1 시간 300 ° C로 혼합물을 가열. 이 솔루션은 명확하고 무색에 붉은 색으로 변경됩니다. 실내 온도에 솔루션을 냉각.
- 카드뮴 솔루션으로 hexadecylamine을 (HDA, 7.0 g)를 추가, 70 열 ° C, 그리고 피난한다. 일정한 압력이 달성되면, 100-110로 온도를 증가 ° C와 30 분에 환류 솔루션을. 불활성 가스로 Schlenk 라인 밸브를 전환하여 솔루션에 직접 열전대를 삽입합니다.
- 공기가없는 조건에서 솔루션에 diphenylphosphine을 (DPP, 100 μl)을 추가하고 310 ° C.에 온도를 증가 0.4 M TOP - 괜찮다 솔루션의 7.5 ML를 제거(3 mmol의 셀레늄) 16 게이지 바늘에 부착 된 일회용 플라스틱 주사기 인치
- 온도가 310 ° C에서 equilibrates되면 0으로 온도 컨트롤러를 설정 ° C 신속 카드뮴 솔루션에 직접 TOP - 괜찮다 솔루션을 주입. 이 솔루션은 노란색 - 오렌지에 무색에서 변경하고 온도가 빠르게 내려 ~ 280 ° C.에 다시 증가합니다 온도가 200보다 ° C. 될 때까지 반응 1 분 후, 가열 망태에서 병을 제거하고 공기의 흐름과 빠르게 쿨
- 온도가 ~ 40에 도달하면 ° C, 30 ML 헥산으로 희석, 대부분의 나머지 카드뮴 전구체 중 솔루션에서 해결됩니다. 원심 분리 (5,000 XG, 10 분)하여 침전물을 제거합니다.
- 여섯 50 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 원심 분리기 튜브의 각에 40 ML의 아세톤, 원심 분리기 (10 분 5,000 XG)와 원유 nanocrystal 솔루션의 12 ML을 희석하고, 신중하게 가만히 따르다하고 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- nanocr를 해산헥산에 ystal 펠릿 (25 ML 총 볼륨). 상단 위상을 유지, 메탄올의 동일한 볼륨으로이 솔루션을 3 번씩 압축을 풉니 다. 세 번째 추출의 경우 메탄올의 양이 약 200 μM에서 순수 CdSe의 QDs의 집중 헥산 용액을 얻기 위해 ~ 15 ML로 조정할 수 있습니다. 이 반응의 전형적인 수율은 2.3 nm의 (50-60% 반응 수율)의 직경 CdSe nanocrystals 3 μmol입니다.
- UV-VIS 흡수 스펙트럼을 측정하고 Mulvaney와 동료 (12)의 크기 피팅 차트와 Bawendi와 동료 (13)의 멸종의 상관 관계를 컨설팅하여 nanocrystal 직경과 집중을 확인합니다. 자세한 내용은 부록을 참조하십시오.
- 수은 양이온 교환 : nanocrystals이 부분적으로 흡수 및 형광 방출 붉은 이동하기 위해 수은이 교환 할 수 있습니다. 3 ML 헥산, 2 ML 클로로포름, 1 ML 200 μM의 CD : stirbar과 20 ML의 유리관 (이 반응은 원하는대로 확장 할 수 있습니다)에 위해 함께 다음을 혼합SE QD 솔루션 (200 nmol), 15 μl oleylamine (안녕) 및 클로로포름에 HG (OT) 2 0.1 M 솔루션 500 μl. 수은 octanethioate (HgOT 2) 수은 아세테이트와 메탄올의 octanethiol를 (부록 참조) 반응에 의해 준비 할 수 있습니다. 양이온 교환 반응 진행으로 붉은 변화의 범위는 UV-VIS 흡수 분광 광도법으로 모니터링 할 수 있습니다. 원하는 흡수 대역이 달성 된 후, 350 nm의에서 nanocrystal 솔루션의 흡수를 측정하고 nanocrystal 농도 (이 예에서는 30.7 μM) 변경되지 않았다는 것을 가정, 새로운 흡광 계수를 결정합니다. unreacted 수은을 제거하여 반응을 해소 : 5 ML decane, 10 ML의 헥산, 7 ML의 메탄올을 추가하고 nanocrystals를 포함하는 상위 단계를 유지 솔루션을 압축을 풉니 다. 헥산 및 메탄올로 두 번 더 추출하고, 상단 단계는 ~ 7 ML이되도록 메탄올의 볼륨을 조정합니다. 단계가 분리 속도가 느린 경우, 솔루션은 (5000 XG, centrifuged 할 수 있습니다10 분). 강수량를 유도하기 위해 40 ML의 아세톤 다음 nanocrystals에 100 μl TOP, 100 μl보세요, 100 μl 올레 산을 추가합니다. 원심 분리를 통해 nanocrystals를 수집, 3 ML의 헥산에 분산. 불용성 구성 요소를 제거하고 350 nm의에서 새로운 흡광 계수를 사용하여 다시 nanocrystal 농도를 결정하기 위해 다시 원심 분리기. 다음 단계로 이동하기 전에 상온에서 최소 24 시간 연령에 nanocrystal 솔루션을 허용합니다.
2. 카드뮴 아연 황화물의 성장 (CD Y 아연 1-Y S) 쉘
- 50 ML 3 목 플라스크에 0.1 M 쉘 전구체 솔루션을 준비합니다. 카드뮴 아세테이트 하이드레이트 (230.5 밀리그램, 1 mmol) 10 ML oleylamine (안녕) : 전구체를 카드뮴. 아연 전구체 : 아연 아세테이트 (183.5 밀리그램, 1 mmol)과 안녕 10 ML. 황 전구체 : 유황 (32.1 밀리그램, 1 mmol) 10 ML ODE. 진공에서 명확한 솔루션을 창출하고 1 시간에 환류 각 솔루션을 가열 한 후 아르곤과 비용이 청구됩니다. 유황 솔루션은 할 수있다실내 온도에 냉각 될 수 있지만, 카드뮴, 아연 전구체는 약 50 유지 ° C. 쉘 전구체 수량의 계산은 참조 14에서 찾을 수 있습니다.
- 3 목 플라스크에 추가 : HG X CD 1-X 놈들이 QDs (120 nmol 2.3 nm의 직경), ODE (2 ML) 및 trioctylphosphine 산화물 (TOPO, 250 MG). Schlenk 줄을 사용 실온에서 헥산을 대피하십시오. 100 ° C와 15 분에 환류에 온도를 높입니다. 아르곤 또는 질소 가스로 Schlenk 라인 밸브를 변경하고 nanocrystal 솔루션에 열전대를 삽입합니다.
- 120의 온도를 증가 ° C, 유황, 전구체 용액의 0.5 monolayers (140 μl)를 추가하고, 반응이 15 분 동안 진행 할 수 있습니다. 작은 aliquots (<50 μl)을 형광 및 / 또는 UV-VIS 흡수 분광 광도법을 사용하여 반응의 진행 상황을 모니터링하기 위해 유리 주사기를 사용하여 제거 할 수 있습니다. 140의 온도를 증가 ° C, 카드뮴 전구체 용액의 0.5 monolayers을 추가 (140 μl)와 반응은 15 분 동안 진행 할 수 있습니다. 반응 솔루션에 올라 500 μl 무수을 추가합니다.
- 160 ° C에서 각 또한 사이 15 분에 170에 아연 전구체 용액의 같은 양에 이어 황 전구체 용액의 0.5 monolayers (220 μl) ° C를 추가합니다. 다음 180의 ° C 유황 전구체 용액 (150 μl)와 15 분 간격으로 아연 전구체 용액의 0.25 monolayers를 추가합니다.
- 실내 온도에 솔루션을 냉각 한 후 다시 nanocrystals의 수가 (3.8 ML 반응 용액 120 nmol) 변경되지 않았다는 것을 가정, UV-VIS 스펙트럼을 사용하여 이러한 입자에 대한 새 흡광 계수를 계산합니다. 냉동실에 원유 혼합으로 반응 용액을 저장, 섹션 1.8 1.9에 설명 된 동일한 방법을 사용하여 필요에 따라 nanocrystals는 해동하고 정화 할 수 있습니다.
- nanocrystals는 전자 현미경, UV-VIS 흡수 분광 및 형광 분광을 사용하여 특징 될 수 있습니다. 양자 수율이 될 수 있습니다통합 영역 또는 상대적으로 참조 15 방법을 사용하여 알려진 표준에 비해를 사용하여 절대적으로 계산됩니다.
3. 단계 전송
- 50 ML 3 목 플라스크에 1-X 놈들이 핵심 / 쉘 HG X CD / CD Y 아연 1 Y S QDs을 (5 ML, 20 μM) 정화 추가 건조 필름을 얻을 수있는 높은 진공 헥산을 제거합니다. 80 nanoparticle 필름 및 열 슬러리에 무수 피리딘 (3 ML)를 추가, 아르곤과 함께 술병을 작성 ° C. 1-2 시간의 과정을 통해 나노 입자가 완전히 분해됩니다.
- 솔루션에 1 thioglycerol (1 ML)를 추가하고 80 저어 ° C를 2 시간에. 그런 다음 실온에 솔루션을 냉각하고 thioglycerol을 deprotonate하는 triethylamine을 (0.5 ML)를 추가합니다. 30 분에 젓는다. 이 솔루션이 용매 혼합물 극 nanocrystals의 가난한 용해도로 인해 triethylamine의 추가 흐린 후 될 수 있습니다.
- 50 ML 원뿔 원심 분리기 관 cont에 QD 솔루션을 전송20 ML의 헥산 20 ML의 아세톤의 혼합물을 aining, 잘 섞는다. 원심 분리 (5,000 XG, 10 분)를 통해 유발 nanocrystals를 분리하고, 아세톤으로 펠릿을 씻는다.
- 수 집계를 제거하는 QD 목욕 sonication과 DMSO의 펠렛 (5 ML)을 입력 한 다음 원심 분리기를 (7000 XG, 10 분) 디졸브. UV-VIS 흡수 스펙트럼에서 nanoparticle 농도를 결정합니다. 표면 thiols 천천히 공기 환경 조건에서 산화 수 있으므로 순수 QDs의이 솔루션은 3 시간 이내에 사용해야합니다.
- DMSO 10 개 μM 이하로 QD 솔루션을 희석하고 50 ML 플라스크에 전송할 수 있습니다. DMSO의 thiolated polyacrylic 산 (부록에 설명 된 합성)의 5 MG / ML 솔루션을 준비합니다. 5 분 동안 실온에서 솔루션을 교반하고 가스를 제거하다하는 동안 QD 솔루션에 dropwise 폴리머 솔루션을 (nmol QDs 당 0.15 밀리그램 폴리머)를 추가합니다.
- 아르곤과 80 열 ° C 90 분에있는 QD / 폴리머 솔루션을 깨끗이. 그런 다음 실온에 솔루션을 냉각D dropwise 50 MM 나트륨 borate, 산도 8 동일한 볼륨을 추가 할 수 있습니다. 10 분 동안 젓는다.
- 50 MM 나트륨 borate, 산도 8 투석 (20 kDa의 컷오프)를 통해 QDs을 정화 한 다음 원심 필터 (10 kDa의 컷오프)를 사용하여 입자를 집중. UV-VIS 흡수 스펙트럼의 농도를 결정합니다.
4. PEG 코팅
- stirbar있는 4 ML 유리 병에, 750 다 monoamino - 폴리에틸렌 글리콜 (30 밀리그램, 40 μmol)의 40,000 X 몰 초과로 borate 버퍼 1 nmol QDs을 섞는다. 특정 화학 기능 nanocrystals (예 : 히드라 지드 또는 maleimide)에 추가 할 경우, 그것은 heterobifunctional 아미노 PEG (30 % 몰분율은 일반적으로 잘 작동)과 아미노 PEG의 일부를 대체하여 도입 할 수 있습니다. borate 버퍼 1 μM에 nanocrystal 솔루션을 희석. 원하는대로이 반응은 축소 될 수 있습니다.
- DMSO (144 μl)에 DMTMM (20 밀리그램, 72 μmol)의 새로운 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 간단히 가열 할 수 있습니다 U탭 물 온수 또는 완전히 DMTMM를 해산하기 위해 목욕 sonicator에 잠겨의 스트림을 nder. 신속 QD 솔루션이 0.5 M DMTMM 솔루션의 25,000 X 몰 초과 (50 μl)을 추가하고 30 분 동안 실온에서 젓는다.
- PEG와 nanocrystal 표면을 포화에 4.2 이상 네 번 단계를 반복합니다. 마지막으로, 반응을 잃게 200 μl 1 M 트리스 버퍼를 추가하고 투석, 원심 필터 또는 ultracentrifugation를 사용하여 nanocrystals를 정화.
- nanocrystals는 monodispersity, 유체 역학적 크기, 액체 크로마토 그래피, 아가로 오스 겔 전기 영동 및 형광 현미경을 사용하여 표면 전하에 대한 분석 될 수있다. 자동 액체 크로마토 그래피 시스템 (GE AKTAprime 플러스)를 사용하여 유체 역학적 크기 및 크기 분포를 확인하려면, 260 또는 280 nm의에서 Superose 6 열, PBS 버퍼 eluent와 0.5 ML / 분의 유량 및 흡수 감지를 사용합니다. 분자량 표준의 사람들과 nanoparticle의 용출 시간을 비교합니다. 아가로 오스 겔 electropho에 대한resis는, 50 MM 나트륨 borate 버퍼 (산도 8.5) 또는 50 MM 나트륨 인산염 버퍼 (산도 7.4)에서 0.5 % 아가로 오스 겔을 준비 우물에 10 % 글리세롤, 부하 1 개 μM 샘플을 혼합하고, 30 분에 100 V에서 실행 . UV 손 지팡이 나 UV의 transilluminator를 사용하여 젤과 형광 여기에 대한 이미지 nanocrystals합니다. 형광 현미경을 사용하여 단일 분자 수준에서의 이미지가 nanocrystals를 위해, 10 MM 인산 버퍼에있는 입자에 0.2 나노 미터를 희석, 유리 coverslip에 솔루션의 2.5 μl를 삭제하고 신중하게 확산 액체 구슬의 상단에 두 번째 coverslip를 배치 coverslips 사이에 필름. 400-580 나노 미터 및 전자 - 배가 CCD 카메라 사이의 파장에서 여기있는 중 epifluorescence 또는 TIRF 모드에서 높은 수치 조리개 목표를 (이상적으로 최소한 1.40)를 사용하여 이미지의 표면에 바인딩 입자. 정확한 이미징 매개 변수 현미경 설정 사이에 다릅니다.
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Representative Results
그림 2는 CdSe nanocrystals, 양이온 교환 후 HG X CD 1-X 놈들의 nanocrystals, 그리고 HG X CD 1-X 놈들이 / CD Y 아연 쉘 성장 후 1-Y S nanocrystals을위한 대표 흡수 및 형광 스펙트럼을 도시한다. 핵심 CdSe의 nanocrystals는 양자 15% 근처에 형광 수율 (긴 파장 깊은 트랩 방출 포함)하지만 효율성이 표면 원자 방해 구를 통해 소개 캐리어 트랩을 청구 할 가능성이 때문에 수은이 교환 한 후 1 % 미만으로 떨어되어 있습니다. 그러나 카드뮴 아연 Y 1 Y S의 얇은 껍질의 성장은 주로 물 (50 % 전형적인)로 전송 한 후 유지 70 % 이상,이 효율성을 향상. 두꺼운 껍질이 성장하지 않는 반면, 수은 설립없이 CdSe / CD Y 아연 1 Y S nanocrystals 물에서의 양자 수율의 실질적인 일부를 잃게됩니다. 따라서 핵심 nanocrysta에 수은을 통합하여나, nanocrystal의 작은 크기는 밝기를 희생하지 않고 (그림 3의 TEM 참조) 유지 될 수 있습니다. 이 변화는 CdSe 코어 16 20-30 nm의 주위에 있으며, 증가와, 그 카드뮴 Y 아연 1 Y S와 캡핑하면 쉘 소재로 전자 충전 사업자의 누출로 인해 빨간색으로 스펙트럼을 주던 있습니다하는 것이 중요합니다 (최대 100 나노 미터)의 핵심에서 수은 함량을 증가합니다.
물 2 단계 상 전송의 사용은 클러스터 및 집계를 제거하려면 정렬 추가로 크기를 요구하지 않습니다 nanocrystals의 균일 한 인구를위한 중요합니다. 첫 번째 단계에서, nanocrystals가 nanocrystal의 표면에 oleylamine을 displaces 1 thioglycerol를 사용하여 DMSO으로 전송됩니다. Thioglycerol는 다음 유기 코팅 (<4 nm의 contributi에서 발생하는 유체 역학적 크기 최소한의 증가와 함께 매우 안정적인 입자의 결과로, 선형 multidentate 폴리머로 대체됩니다유체 역학적 직경)를 선택합니다. 도 4a에 도시 된 크기 제외 크로마토 그램의 크기가 conalbumin (75 kDa)의 비슷되었음을 확인하고, 750 다 아미노 PEG로 변경 한 후, 크기는 약 12 nm의에 IgG 항체와 유사한 증가 . PEG 수정은 그림 4b에 도시 된 아가로 오스 겔 전기 영동 실험에서 확인 표면 전하를 중화. 우리는 정기적으로 신속하게 크기의 특성, 크기 분포, 그리고 표면 전하에 대한 크기 배제 크로마토 그래피와 겔 전기 영동을 사용합니다. 동적 광 분산 및 제타 potentiometry도하지만 산란이 ultrasmall 입자의 단면은 매우 작고, 우리는 상업 악기의 결과가 재현되지 사실을 발견 한 사용할 수 있습니다. 그림 5A 이러한 nanocrystals의 epifluorescence 현미경이 상에 증착 보여줍니다 유리 coverslip와 545 nm의 눈에 보이는 빛으로 흥분. 이러한 nanocrystals은 쉽게 O 아르. 전자 - 배가 CCD 카메라와 초당 30 프레임의 단일 분자 수준에서 bserved 그림 5b는 각 프레임에서 관찰 형광 입자의 수는 지속적으로 여진과 시간이 지남에 변동을 나타냅니다,이 점멸하고 photodegradation의 조합 때문입니다 . 산화 photodegradation 천천히 명백한되기 전에 점멸 첫 번째 ~ 7 분 동안 장악.
nanoparticle 합성 절차의 그림 1. 도식의 묘사. (가) 카드뮴과 셀레늄 전구체는 HG X CD 1-X 놈들의 3 원 합금 nanocrystals를 얻을 수 있도록 부분 카드뮴 → HG의 양이온 교환을 유도 수은 octanethiolate로 취급됩니다 CdSe nanocrystals을 생성하는 반응. 카드뮴 아연 Y 1 Y S의 쉘 그런 다음 카드뮴 아세테이트, 아연 아세테이트, 그리고 유황을 사용하여 핵심 성장하고 있습니다. (B) synt으로hesized이 nanocrystals는 무극성 유기 리간드 (oleylamine)으로 코팅되어 있습니다. 수성 버퍼에서 이러한 입자를 solubilize하려면 리간드는 covalently 아미노 PEG에 커플 링된다 multidentate 고분자 리간드와 대체됩니다.
그림 2. 1-X 놈들이 HG X CD / CD Y 아연 1 Y S nanocrystals의 광학 특성. (A) 흡수 (검은 색)와 CdSe nanocrystal 코어의 형광 스펙트럼 (빨간색), HG X CD 1-X 놈들 코어 양이온 교환 후, 그리고 HG X CD 1-X 놈들이 / CD Y 아연 쉘 성장 후 1-Y S nanocrystals . 스펙트럼은 1-X 놈들이 HG X CD / CD Y 아연 수은 설립의 다른 상대적인 양 1-Y S의 명확성 (B) 형광 스펙트럼에 대한 오프셋입니다. 파란 스펙트럼은 제로 수은 함량 (X = 0, CdSe)와 코어를 도시한다.
그림 3. 전송 전자 현미경 (A) 및 (b) 1-X 놈들이 HG X CD / CD Y 아연 1 Y S의 nanocrystals의 입자 크기 분포는 평균 직경 ± 3.2 표준 편차 ± 0.6 nm의을 보여줍니다.
그림 4. 1-X 놈들이 HG X CD / CD Y 아연 수용액 1-Y S QDs의 유체 역학적 특성. (A) nanocrystals의 크기 제외 크로마토 그램은 아미노 PEG에 (파란색) 활용하기 전에 (빨간색)와 후 multidentate 고분자 리간드로 코팅. 분자량 단백질 표준은 플롯 위에 표시됩니다. 이전 나트륨 borate 버퍼에있는 QDs의 (B) 아가로 오스 겔 전기 영동 실험 (산도 ~ 8.5) (왼쪽아미노 PEG까지)과 후 (오른쪽) 활용. 잘은 음이온 입자와 PEGylated nanocrystals이 electrostatically 중성 그대로 활용하기 전에 nanocrystals 마이그레이션을 보여, 화살표 및 전극 극성 오른쪽에 표시됩니다가 표시되어 있습니다.
그림 5. HG X CD 1-X 놈들이 / CD Y 아연 1 Y epifluorescence 현미경과 이미지로 인산 버퍼에 유리 coverslip에 adsorbed S의 QDs. (A) QD 이미지는 초당 33 프레임 획득하였습니다. 이미지는 15 μm X 15 μm이다. 545 나노 미터 (30 나노 미터 대역 통과) 여기 필터와 수은 아크 램프가있는 20 분 및 625 nm의 (20 나노 미터 대역 통과) 방출 필터 및 100x 1.4 NA 목표에 대한 지속적인 조명 중 한 시야 당 형광 QDs의 (B) 수입니다. 보기의 3 분야의 측정은 초당 12.5 프레임 20 분 이상 평균되었습니다.
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Discussion
기존의 CdSe 양자 점에 비해, 삼원 합금 HG X CD 1-X 놈들의 nanocrystals는 크기와 독립적으로 형광 파장에서 조정 할 수 있습니다. 크기가 처음 CdSe nanocrystal 코어의 합성 중에 선택되어 있으며, 형광 파장은 실질적으로 nanocrystal 크기 9 변경하지 않는 보조 수은 양이온 교환 단계에서 선택됩니다. 그것은 정화 HG X CD 1-X 놈들의 nanocrystals이 상한 전에 최소 24 시간 동안 실온에서 배양 할 수 있도록하는 것이 중요합니다. 이 약하게 adsorbed 수은 양이온의 일부가 nanocrystal 격자로 확산 할 수 있습니다. 이 과정은 가까운 적외선에서 두 번째 형광 밴드 발생 할 수없이 자주 dissociated 수은 이온의 HgS nanocrystals의 균일 한 핵으로 인해 관찰된다.
이 작품에 표시된 예제에서, 우리는 할 수있는 2.3 나노 미터 가까운 크기 CdSe 코어를 준비핵심 격자에 포함 수은의 양을 변경하여 캡핑 후 550-800 nm의 사이 형광에 주목 해 주시기 바랍니다. 2.5 monolayer 쉘을 통해 이러한 QDs의 최종 직경은 본질적으로 우리는 단일 분자 이미징을 위해 충분히 photostable와 충분히 밝은 모두입니다 준비 할 수있는 작은 크기의 nanoparticle (350,000 근처 흡광 계수 M -1 cm입니다, 3.2 nm의 근처 400 나노 미터와 물 50 % 가까이 양자 수율에서 -1). 이러한 nanocrystals은 실질적으로 밝게하고이 스펙트럼 범위 (예 : CdTe, InAs, InP)을 통해 방출 비교 크기가 이전에 설명 nanocrystals보다 더 photostable 있습니다. 대부분의 fluorophores과 마찬가지로, 단일 분자 수준에서 이러한 입자의 형광은 (점멸) 5,6 간헐적입니다.
일부 응용 프로그램의 경우는 다소 큰 nanocrystals를 사용하여 도움이 될 수 있습니다. 큰 CdSe nanocrystal 코어, 형광 bandwi를 사용하여dth는 수은 양이온 교환 후 좁은입니다. 600-650 nm의 창에서 방출와 HG X CD 1-X 놈들의 nanocrystals에 대한 일반적인 형광 피크 폭은 2.3 nm의 코어를위한 50-70 nm의와 3.2 nm의 코어에 40-50 nm의 수 있습니다. 따라서, 큰 nanocrystals는 스펙트럼 멀티플렉싱을위한 더 큰 용량을 사용할 수 있습니다. 또한, 크기를 늘리면 마찬가지로 nanocrystals의 흡수 단면이 높아집니다. CDS 중간 쉘 층의 두께를 증가하면 밝기를 증가하고, 더 여기 중에 형광 안정성을 연장합니다. CdSe 코어 크기는 CdSe 코어 합성 기간을 연장하고, UV-VIS 흡수 분광 광도법을 통해 효과적인 크기를 모니터링하여 간단하게 증가 될 수있다.
우리는 카르 복실 산으로 코팅 수성 QDs는 세포와 단백질 특이 현상 흡착 경향이있는 것으로 나타났습니다, 그리고 생리 버퍼에서의 강한 부정적인 요금의 중화는 CR입니다특이 현상의 상호 작용 17을 최소화하기위한 itical. 여기 예제에서, 우리는 표면 전하를 중화하고 물에 안정성을 유지하기 위해 짧은 체인 PEG를 사용했습니다. PEG는 QDs에 첨부하기 전이나 코팅 후에 폴리머 백본에 도입 할 수 있습니다. 절차 거의 중성 입자의 결과,하지만 복실 폴리머있는 사람 첫째 코팅 모두 표면의 개선 multidentate 상호 작용으로 인해 아마도, 실질적으로 작습니다. PEG를 갖춘 표면 중화를 들어, 카르 복실 산의 활성화 에이전트의 반복 또한 인해 반응성 종의 반감기 짧은에 필요한 것으로 나타났습니다. 우리는 때문에 향상된 스토리지에 DMTMM의 안정성 및 물 18에 개선 반응 효율로 인해 더 많은 일반적인 carbodiimide의 시약의 장소 (예 : EDC)에 DMTMM 사용합니다.
마지막으로, nanocrystals의 양자 점 및 다른 많은 종류가 포함되어 있습니다하는 것이 중요합니다세포 독성 요소 5. 카드뮴 및 수은 이온 살아있는 세포와 생물의 일반적인 프로세스에 영향을 미칠 수 있으며, 발암 19-21있을 수 있습니다. 그러나 기존의 CdSe / ZnS의 nanocrystals의 세포 독성이 널리 연구되었고 그 사람들의 독성 요소가 효율적으로 산화 대리인 멀리 격리 아르 단순히 때문에, 안정적인 유기 리간드와 견고 코팅 nanocrystals가 자신의 구성 요소에 비해 명백히 세포 독성 반응을 유도하지 않는 것이보고되었습니다 5. 또한, 단일 분자 이미징 응용 프로그램, 독성 효과는 감지 독성 효과 (50-100 NM)의 발병보다 더 작은 크기의 명령 이미징 (일반적으로 1 나노 미터 이하)에 사용되는 매우 작은 농도에 가능성 때문입니다. 날짜로 QDs을 구현하는 단일 분자 실험의 대부분은 상업적으로 이용 가능한 CdSe / 여기에 설명 된 것보다 실질적으로 큰 ZnS의 nanocrystals을 활용하고 있습니다. n을 최소화하여anocrystal 크기는 입자와 입자 당 독성 원자의 총 개수에 따라 표면 원자의 총 수는 실질적으로이를 toxicological 미치는 영향에 대한 총 잠재력을 감소 감소된다. nanocrystal에 수은의 결합은 이가의 수은이 많은 세포 유형 19-21에서 이가의 카드뮴보다 독성이 알려져있다으로 독성 가능성을 더욱 줄일 것으로 예상된다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 전자 현미경 영상에 모리 대학의 통합 현미경 코어에서 박사 홍콩 이순신 감사드립니다. 이 작품은 (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 및 1K99CA154006-01) NIH 교부금의 후원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Selenium | Sigma-Aldrich | 229865 | |
| Tri-n-octylphosphine | Strem | 15-6655 | 97% pure, unstable in air |
| Cadmium oxide | Sigma-Aldrich | 202894 | Highly toxic: use caution |
| Tetradecylphosphonic acid | PCI Synthesis | 4671-75-4 | |
| Octadecene | Alfa Aesar | L11004 | Technical grade |
| Hexadecylamine | Sigma-Aldrich | H7408 | |
| Diphenylphosphine | Sigma-Aldrich | 252964 | Pyrophoric |
| Mercury acetate | Sigma-Aldrich | 456012 | Highly toxic: use caution |
| 1-Octanethiol | Sigma-Aldrich | 471836 | Strong odor |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | W281506 | |
| Zinc acetate | Alfa Aesar | 35792 | |
| Cadmium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 229490 | Highly toxic: use caution |
| Oleylamine | Fisher Scientific | AC12954 | Unstable in air |
| Sulfur | Sigma-Aldrich | 344621 | |
| Trioctylphosphine oxide | Strem | 15-6661 | 99% |
| Pyridine | VWR | EM-PX2012-6 | Anhydrous |
| Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753 | Strong odor |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | Anhydrous |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 131342 | 20 kDa cutoff |
| Centrifugal filter | Millipore | UFC801024 | 10 kDa cutoff |
| Monoamino-PEG | Rapp Polymere | 12 750-2 | 750 Da |
| DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate | Alfa Aesar | H26333 | |
| AKTAprime Plus Chromatography System | GE HealthCare | ||
| Superose 6 10/300 GL chromatography column | GE HealthCare | 17-5172-01 | |
| Agarose, OmniPur | VWR | EM-2120 | |
Appendix Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum. Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercapt–thanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon. Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12:
Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer's Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13:
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