Plakk analysen for Murine Norovirus

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å kvantifisere infeksiøse partikler av murin norovirus (MNV), som er den eneste norovirus som effektivt replikerer i cellekultur. Plakett analysen utnytter MNV største tropisme for murine makrofager, og kan tilpasses for bruk med biologiske eller miljøprøver inneholdende MNV.

Abstract

Murine norovirus (MNV) er det eneste medlemmet av Norovirus slekten som effektivt vokser i vev kultur ^{1, 2.} Cellelyse og cytopatisk effekt (CPE) observeres under MNV-1-infeksjon av murine dendrittiske celler eller makrofager ^en. Denne egenskapen av MNV-1 kan brukes til å kvantifisere antallet av infeksiøse partikler i en gitt prøve ved å utføre en plakett assay ^1. Plakett analysen er avhengig av evnen av MNV-1 til å lysere cellene og til å danne hull i en konfluent celle monolag, som kalles plakk ^3.

Flere teknikker kan brukes til å detektere virusinfeksjoner i vevskultur, høstes vev, klinisk og miljøprøver, men ikke alle måle antall infeksiøse partikler (f.eks QRT-PCR). En måte å kvantifisere infeksiøse viruspartikler er å utføre en plakett assay ^3, som vil bli beskrevet i detalj nedenfor. En variant på MNV plakk analysen er fluorescent fokus analysen, hvor MNV antigen immunostained i celle monolayers ^4. Denne analysen kan være raskere, siden virusantigen uttrykk forut plakkdannelse. Det er også nyttig for titrering virus ikke kan danne plakk. Imidlertid krever fluorescerende fokus analysen ytterligere ressurser utover de av plakk analysen, for eksempel antistoffer og et mikroskop for å telle fokus-dannende enheter. Infeksiøs MNV kan også kvantifiseres ved å bestemme 50% Tissue Culture infeksiøs dose (TCID ₅₀₎ ^3. Denne analysen måler mengden av virus nødvendig for å produsere CPE i 50% av inokulerte vevskultur cellene ved endepunkt titrering ^5. Imidlertid er dens deteksjonsgrensen høyere sammenlignet med en plakett assay ^4.

I denne artikkelen beskriver vi en plakett analyseprotokollen som kan brukes for effektivt å bestemme antall infeksiøse MNV partikler tilstede i biologiske eller miljøprøver ^{1, 4, 6.} Denne metoden er based på fremstillingen av 10-fold serielle fortynninger av MNV-holdige prøver, som brukes for å inokulere et monosjikt av ettergivende celler (RAW 264.7 murine macrophage celler). Virus er tillatt å feste til cellen monolaget for en gitt tidsperiode, og deretter suget før dekker celler med en blanding av agarose og cellekulturmedier. Agar muliggjør spredning av viral avkom til nabocellene samtidig begrense spredning til fjernt beliggende celler. Følgelig er infiserte celler lysert og danner hull i monolaget kjent som plakk. Ved tilstrekkelig spredning av virus, plaques blir synlige etter farging av cellene med fargestoffer, som nøytral rød, metylen blått, eller krystallfiolett. Ved lave fortynninger, stammer hver plakk fra en smittende viral partikkel og dens avkom, som spredte seg til nabocellene. Således, telle antall plakk tillater en å beregne plakk-dannende enheter (PFU) tilstede i den ufortynnede prøven ^3.

Protocol

1. Dyrking av Macrophage cellelinje RAW 264,7 Oppretthold RAW 264,7 celler (ATCC, katalog # TIB-71) i DMEM-10 medium, som består av høy glukose DMEM med 10% (v / v) med lav endotoksin føtalt bovint serum (<10 eu > Merk: Det er lurt å ha flere flasker med autoklaverte SeaPlaque agarose forberedt på forhånd. Agarose kan bli re-smeltet i en mikrobølgeovn før bruk. Beregne mengden overlegget for det totale volum av platene før 1 timers inkubasjon er fullført. Volumet trengs er 2 ml / brønn eller 12 ml/6-well plate. Forbered agarose (se pkt. 3.2) og media (se kapittel 3.3) separat. For å forberede agarosen, suspendere 3 g SeaPlaque agarose i et totalt volum av 100 ml destillert vann (3% w / v) i en glassflaske. Autoklaveres for 20-30 min. (Hvis agarose var allerede forberedt før hånd, re-smelte agarose i mikrobølgeovn.) Det er viktig å ekvilibrere SeaPlaque agarose til 42 ° C i et vannbad før bruk fordi hvis agarosen er for varmt, vil det drepe cellene. Kontroller vannivå er lik eller over nivået for agarose for å unngå uønsket størkning. For å fremstille mediene: gjør 100 ml 2x MEM medier, som består av2x MEM, 10% (v / v) med lav endotoksin føtalt bovint serum (<10 eu >

Discussion

Plakett analysemetode for MNV-1 presenteres her er en måte å synliggjøre smittsomme MNV partikler. Ved å følge analyseresultatene trinnene illustrert i figur 3, kan en oppnå reproduserbare virale titere. Påvisningsgrensen til analysen avhenger av startvisningen fortynning brukt. Når man starter med en 1:10 fortynning av prøven som beskrevet ovenfor, er grensen for deteksjon av plakket analysen 10 PFU (dvs. en plakk synlig på 10 ^-1 fortynning). Siden hver plakk representerer en enkelt virus, kan plakett analysen også brukes til å rense klonale bestander av MNV ved å plukke isolerte plakk og spre dem som beskrevet tidligere ^1. I tillegg kan plakk renselser også brukes til å separere et individuelt viruspopulasjonen fra blandede virus populasjoner. En begrensning av bruk en plakett assay for påvisning av MNV infeksjon er at ikke alle MNV stammer danne plakk ^4. Imidlertid kan det være mulig å overvinne inability til noen MNV stammer, isolert fra dyr, for å danne plakk ved serielt passaging disse virusene i vevskultur ^7. Et alternativ til plakk-analysen er å måle infeksiøse partikler via TCID ₅₀ teknikken ^{3, 4.} Denne analysen tallfester hvor mye virus som kreves for å produsere CPE i 50% av inokulerte vev kultur celler etter endepunktet fortynninger og tar en uke å fullføre for MNV ^4. I tillegg til å være lavere enn en plakett assay er TCID ₅₀ analysen også ikke like følsom (deteksjonsgrense = 200 TCID ₅₀ / ml) på grunn av giftigheten av vevsprøver til RAW 264,7 celler ^4.

Selv kritiske trinnene i protokollen har blitt beskrevet hele protokollen, gir følgende avsnitt et sammendrag til rette feilsøking. Den mest kritiske trinn i protokollen, er å sikre at RAW 264,7 celler forblir levedyktig hele analysen å støtte virusreplikasjon. Dette kanovervåkes på hvert trinn av analysen via lysmikroskopi. Celleviabilitet sikres på to måter. Først, bør man være forsiktig for ikke å la cellene tørke ut mens håndtering plater. Således beveger platene inokuleres en om gangen, rocked under infeksjonen perioden, og bør forbli lukket når de ikke blir håndtert. Sekund, løsninger lagt inn celler bør være ekvilibrert til ~ 37 ° C. Videre er det viktig for den generelle helsen RAW 264,7 celler for å opprettholde dem i medier som inneholder lav endotoksin serum (<10 EU / ml), som begrenser aktivering av celler. I tillegg har vi observert en høyere feilrate av plakket analysen ved bruk celler fra passasje 30 eller høyere. Selv om dette vil sannsynligvis variere fra laboratorium til laboratorium, er det viktig å ta med en positiv kontroll (for eksempel en prøve med en kjent viral titer) for å sikre reproduserbare titere, spesielt når man bruker høyere passage RAW 264,7 celler. Å begrense bruk av høyere passasje celler, er det tilrådelig å fryse ampuller med tidlig passage celler ved mottak av RAW 264,7-celler og starte en ny kultur fra de frosne ampuller ofte. Starte på nytt med lav passasje cellekulturer vil også være nyttig når cellene viser endrede egenskaper, for eksempel unnlatelse av å følge, endringer i celle morfologi (f.eks fra runde til spinkel og spredt), eller når mycoplasma forurensning er oppdaget. Et annet viktig poeng å ta hensyn til, er å sikre at pipettespissene endres mellom prøvene og under fortynninger. Dette vil sikre nøyaktige seriefortynninger og hindre krysskontaminering mellom prøvene. Den ett trinn i protokoll der samme pipettespissen kan brukes igjen er når serielle fortynninger av den samme prøven tilsettes til brønnene. I så fall bør man starte fra mest fortynnede inokulatet til det minste, og kraftig pipetteres opp og ned når du tegner opp en ny fortynning.

Plakett analyseprotokollen er amendable til flere endringer. Én modifikasjon som kan bli gjort når ther er ikke nok celler for inokulere brønner i duplikat er å inokulere bare en enkelt brønn for hver fortynning. Men siden inokulatet volumet er 0,5 ml, må antallet plaques deretter å bli multiplisert med en faktor på 2 for å normalisere til pfu / ml. Plakett Målingen kan også tilpasses for bruk med hvilken som helst annen vedheftende cellelinje som er i stand til å støtte replikering av MNV, og dette har blitt beskrevet for den murine microglial BV-2 cellelinje ^8. Andre endringer som kan gjennomføres er tilpasninger som er beskrevet for plakk analysen protokoller utviklet for andre virus. Ved MNV, har følgende modifikasjoner allerede gjennomført vellykket, bruk av metyl cellulose istedenfor Hav Plaque agarose ^9, og farging av celler med krystallfiolett eller metylenblått istedenfor nøytral ^{10 rød, 11.}

Samlet kan denne protokollen lett tilpasses etter behov for å kvantifisere andre plakk-forming virus eller brukes til OTHeh virus som forårsaker lytiske infeksjoner i RAW 264,7-celler, noe som gjør den til et nyttig verktøy for å kvantifisere infeksiøse viruspartikler generelt.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010
10 mM Non-essential amino acids	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine	Hyclone	SH30034.01
Fetal Bovine Serum	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose	Lonza	50100
Neutral Red 0.33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Magna Lyser Instrument	Roche	03358968001
Raw 264.7 cell line	ATCC	TIB-71
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC