Ensaio de placas para Norovirus Murine

Summary

Descrevemos aqui um método para quantificar a partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que é o único que norovirus replica eficientemente em cultura celular. O ensaio de placas aproveita tropismo MNV por macrófagos murinos e pode ser adaptado para utilização com amostras biológicas ou ambientais que contenham MNV.

Abstract

Norovirus murino (MNV) é o único membro do género Norovirus que cresce de forma eficiente em cultura de tecido ^{1, 2.} A lise celular e efeito citopático (CPE), são observados durante MNV-1 infecção de células dendríticas ou macrófagos murinos ^1. Esta propriedade de MNV-1 pode ser utilizado para quantificar o número de partículas infecciosas de uma amostra dada pela realização de um ensaio de placas ^1. O ensaio de placa depende da capacidade de MNV-1 para lisar as células e para formar buracos em uma monocamada confluente de células, as quais são chamadas placas ^3.

Várias técnicas podem ser usadas para detectar infecções virais em culturas de tecidos, o tecido colhido, clínicas e amostras ambientais, mas não toda a medida do número de partículas infecciosas (por exemplo, qRT-PCR). Uma forma de quantificar partículas virais infecciosas é realizar um ensaio de placa ^3, que será descrita em detalhe abaixo. Uma variação no ensaio de placa é o flúor MNVensaio de focagem escent, onde o antigénio é MNV imunocoradas em monocamadas de células ^4. Este ensaio pode ser mais rápido, uma vez que a expressão do antigénio viral precede a formação de placa. Também é útil para a titulação de vírus incapazes de formar placas. No entanto, o ensaio de foco fluorescente exige recursos adicionais para além dos do ensaio de placa, tais como anticorpos e um microscópio para contagem de unidades formadoras de foco. Infecciosa MNV pode também ser quantificada por meio da determinação dos 50% Dose infecciosa em cultura de tecidos (TCID ₅₀₎ ^3. Este ensaio mede a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas por titulação de ponto de extremidade ^5. No entanto, o seu limite de detecção é maior em comparação com um ensaio de placa ^4.

Neste artigo, descreve-se um protocolo de ensaio de placa que podem ser usados ​​para determinar de forma eficaz o número de partículas infecciosas mnv presentes nas amostras biológicas ou ambientais ^{1, 4, 6.} Este método é based sobre a preparação de diluições de 10 vezes em série de amostras contendo MNV, que são utilizados para inocular uma monocamada de células permissivas (células RAW 264.7 de macrófagos murinos). Vírus é permitido para anexar a monocamada de células durante um determinado período de tempo e, em seguida, aspirado antes de cobrir as células com uma mistura de agarose e meio de cultura celular. O agar permite a propagação da descendência virai de células vizinhas, enquanto limita a propagação de células distantemente localizado. Em consequência, as células infectadas são lisadas e os furos formam na monocamada conhecidos como placas. Após a propagação de vírus suficiente, as placas tornam-se visíveis após a coloração das células com corantes, como o vermelho neutro, azul de metileno ou violeta de cristal. Em diluições baixas, cada placa origina de uma partícula infecciosa viral e sua descendência, que se espalhou para as células vizinhas. Assim, a contagem do número de placas permite calcular unidades formadoras de placas (PFU) presentes na amostra não diluída ^3.

Protocol

1. A cultura da linha celular de macrófagos RAW 264.7 Manter células RAW 264.7 (ATCC, catálogo # TIB-71) em meio DMEM-10 media, que consiste em glucose alta DMEM com 10% (v / v) de endotoxina baixa de soro fetal bovino (<10 eu > Nota: é aconselhável ter várias garrafas com autoclavado SeaPlaque agarose preparado antes do tempo. De agarose podem ser re-fundidas num forno de microondas antes de usar. Calcular a quantidade de sobreposição necessário para o volume total de placas, antes de 1 h de incubação estiver completa. O volume necessário é de 2 ml / cavidade ou 12 ml/6-well placa. Prepare agarose (ver secção 3.2) e media (ver secção 3.3) separadamente. Para preparar a agarose, suspender 3 g de agarose SeaPlaque, num volume total de 100 ml de água destilada (3% w / v) num frasco de vidro. Autoclave por 20-30 min. (Se agarose foi já preparado de antemão, re-fundida de agarose em microondas.) É importante equilibrar SeaPlaque agarose a 42 ° C num banho de água antes da sua utilização, porque se a agarose é muito quente, que vai matar as células. Certifique-se o nível de água é igual a ou superior ao nível de agarose a fim de evitar a solidificação indesejável. Para preparar os meios de comunicação: fazer 100 ml de 2x MEM mídia, que consiste em2x MEM, 10% (v / v) de endotoxina de soro fetal bovino baixo (<10 eu >

Discussion

O método de ensaio de placa para MNV-1 aqui apresentado é uma forma de quantificar partículas infecciosas MNV. Seguindo os passos de ensaio ilustrado na Figura 3, pode-se obter títulos virais reprodutíveis. O limite de detecção do ensaio depende da diluição de partida utilizado. Ao iniciar com uma diluição de 1:10 da amostra, tal como descrito acima, o limite de detecção do ensaio de placa é de 10 pfu (isto é, uma placa visível na diluição 10 ^-1). Uma vez que cada placa representa um único vírus, o ensaio de placa pode também ser utilizado para purificar as populações clonais de MNV escolhendo placas isoladas e propagando-los conforme descrito anteriormente ^1. Além disso, a purificação de placas também pode ser usado para separar uma população de vírus individuais a partir de populações mistas de vírus. Uma limitação do uso de um ensaio de placas para a detecção de infecção MNV é que nem todas as estirpes mnv formar placas ^4. No entanto, pode ser possível ultrapassar o inabilidade de algumas estirpes de MNV, isolados a partir de animais, para formar placas em série passaging destes vírus em cultura de tecido ^7. Uma alternativa para o ensaio de placa é o de medir partículas infecciosas por meio da técnica de TCID ₅₀ ^{3, 4.} Este ensaio quantifica a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas seguintes diluições de ponto de extremidade e leva 1 semana para completar para MNV ^4. Além de ser mais lento do que um ensaio de placa, o ensaio de TCID ₅₀ também não é tão sensível (limite de detecção = 200 TCID ₅₀ / ml), devido à toxicidade de amostras de tecido de células RAW 264.7 ^4.

Embora passos críticos no âmbito do protocolo foram descritos ao longo do protocolo, a seção seguinte apresenta um resumo para facilitar a resolução de problemas. Os passos mais importantes do protocolo é o de assegurar que as células RAW 264.7 permanecem viáveis ​​ao longo do ensaio para suportar a replicação do vírus. Isto podeser monitorizado em cada fase do ensaio por meio de microscopia de luz. A viabilidade celular é assegurada de duas maneiras. Primeiro, deve ser tomado cuidado para não deixar secar as células durante o manuseio de placas. Assim, as placas são inoculadas um de cada vez, agitou durante o período de infecção, e devem permanecer fechadas quando não estão a ser tratadas. Em segundo lugar, as soluções adicionado em células devem ser equilibradas para ~ 37 ° C. Além disso, é essencial para a saúde geral das células RAW 264.7 de mantê-las em meio contendo soro de endotoxina baixa (<10 EU / ml), o que limita a activação de células. Além disso, observou-se uma maior taxa de falha do teste de placa quando são usadas células de passagem 30 ou superior. Embora isso provavelmente irá variar de laboratório para laboratório, é importante incluir um controlo positivo (por exemplo, uma amostra com um título conhecido viral) para assegurar títulos reprodutíveis, especialmente quando se utiliza mais elevadas de passagem células RAW 264.7. Para limitar a utilização de células mais elevadas de passagem, é aconselhável congelar frascos de Passa precocecélulas ge após o recebimento de células RAW 264.7 e iniciar uma nova cultura dos frascos congelados freqüência. Começando por cima, com culturas de células de passagem baixa também será útil quando as células apresentam características alteradas, tais como a incapacidade de aderir, as alterações na morfologia celular (por exemplo, de volta para espigado e espalhar-se), ou quando a contaminação por micoplasma foi detectado. Outro ponto importante a prestar atenção é para garantir que ponteiras são trocadas entre as amostras e durante diluições. Isto irá assegurar precisas diluições seriadas e evitar a contaminação cruzada entre as amostras. O primeiro passo no protocolo em que a ponta da pipeta mesmo pode ser utilizado de novo, quando é diluições em série de uma mesma amostra são adicionados aos poços. Nesse caso, a pessoa deve começar a partir do inóculo mais diluído para o mínimo, e vigorosamente pipetar cima e para baixo ao elaborar uma nova diluição.

O protocolo de ensaio de placa pode ser alterada a várias modificações. Uma modificação que pode ser feita quando taqui não são suficientes para a inoculação de células de poços em duplicado é apenas para inocular um único poço de cada diluição. No entanto, uma vez que o volume de inoculo é de 0,5 ml, o número de placas, em seguida, tem de ser multiplicado por um factor de 2 para normalizar a pfu / ml. O ensaio de placa pode também ser adaptado para utilização com qualquer linha celular aderente outro que é capaz de suportar a replicação de MNV, e esta tem sido descrita para a linha microglial murino BV-2 de ⁸ células. Outras modificações que podem ser aplicadas são as adaptações que foram descritas para os protocolos de ensaio de placas desenvolvidas em outros vírus. Em caso de MNV, as seguintes modificações já foram implementadas com sucesso, a utilização de celulose de metilo em vez de agarose Sea Plaque ^9, e coloração das células com violeta de cristal ou azul de metileno em vez de vermelho neutro ^{10, 11.}

No geral, este protocolo pode ser facilmente adaptado, conforme necessário para quantificar outros formadoras de placas de vírus ou utilizados para other vírus que causam infecções líticas em RAW 264,7 células, tornando-se uma ferramenta útil para quantificar partículas virais infecciosas em geral.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010
10 mM Non-essential amino acids	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine	Hyclone	SH30034.01
Fetal Bovine Serum	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose	Lonza	50100
Neutral Red 0.33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Magna Lyser Instrument	Roche	03358968001
Raw 264.7 cell line	ATCC	TIB-71
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC