Plaque Assay for murin Norovirus

Summary

Her beskriver vi en fremgangsmåde til at kvantificere infektiøse partikler af murin norovirus (MNV), som er den eneste norovirus, som effektivt replikerer i cellekultur. Plak-assayet udnytter MNV s tropisme for murine makrofager og kan tilpasses til anvendelse med biologiske eller miljømæssige prøver indeholdende MNV.

Abstract

Murin norovirus (MNV) er det eneste medlem af norovirus slægten, der effektivt vokser i vævskultur ^{1, 2.} Cellelyse og cytopatisk virkning (CPE), i løbet af MNV-1-infektion af murine dendritiske celler eller makrofager ^1. Denne egenskab ved MNV-1 kan anvendes til at kvantificere antallet af infektiøse partikler i en given prøve ved at udføre en plakassay ^1. Plak-assayet er baseret på evnen hos MNV-1 for at lysere cellerne og til dannelse af huller i et sammenflydende cellemonolag, der kaldes plaques ^3.

Flere teknikker kan anvendes til påvisning af virusinfektioner i vævskultur, høstet væv, kliniske og miljømæssige prøver, men ikke alle måle antallet af infektiøse partikler (f.eks qRT-PCR). En måde at kvantificere infektiøse viruspartikler er at udføre en plakassay ^3, som vil blive beskrevet detaljeret nedenfor. En variant af MNV plakassay er fluorescent fokus assay, hvor MNV antigen immunfarvet i cellemonolag ^4. Dette assay kan være hurtigere, da viral antigenekspression forud plakdannelse. Det er også nyttigt til titrering vira ikke kan danne plaques. Men det fluorescerende fokus assayet kræver flere midler ud over dem af plaque-assay, såsom antistoffer og et mikroskop for at tælle fokus-dannende enheder. Infektiøs MNV kan også kvantificeres ved at bestemme den 50% Tissue Culture infektiøs dosis _(TCID50) ^3. Denne analyse måler mængden af virus krævet for at producere CPE i 50% af inokulerede vævskulturceller ved endpoint titrering ^5. Men dens detektionsgrænse er højere end i en plaqueanalyse ^4.

I denne artikel beskriver vi en plaqueanalyse protokol der kan anvendes til effektivt at bestemme antallet af infektiøse MNV partikler er til stede i biologiske eller miljømæssige prøverne ^{1, 4, 6.} Denne metode er based om forberedelsen af ​​10 gange serielle fortyndinger af MNV-holdige prøver, som anvendes til podning af et monolag af tolerante celler (RAW 264.7 murine makrofager celler). Virus får lov at binde sig til cellemonolaget i en bestemt tidsperiode og derefter suget før tildækning celler med en blanding af agarose og celledyrkningsmedier. Agaren muliggør spredning af virale afkom til naboceller og samtidig begrænse spredning til fjernt beliggende celler. Følgelig er inficerede celler lyseres og danner huller i monolag kendt som plaques. Ved tilstrækkelig spredning af virus, bliver plaques synlige efter farvning af celler med farvestoffer, såsom neutral rød, methylenblåt eller krystalviolet. Ved lave fortyndinger, stammer hver plak fra en infektiøs viruspartikel og dets afkom, som bredte sig til naboceller. Således, at tælle antallet af plaques gør det muligt at beregne plaque-dannende enheder (PFU) til stede i den ufortyndede prøve ^3.

Protocol

1. Dyrkning af makrofagcellelinie RAW 264,7 Opretholde RAW 264.7-celler (ATCC, katalog # TIB-71) i DMEM-10 medie, som består af høj glucose DMEM med 10% (volumen / volumen) lavt endotoksin føtalt bovint serum (<10 eu > Bemærk: det er tilrådeligt at have flere flasker med autoklaveret SeaPlaque agarose tilberedt i forvejen. Agarose kan omsmeltes i en mikrobølgeovn før brug. Beregning af overlay kræves til det samlede volumen af ​​plader før 1 times inkubation er fuldstændig. Den nødvendige volumen er 2 ml / brønd eller 12 ml/6-well plade. Forbered agarose (se afsnit 3,2) og medier (se afsnit 3,3) separat. Til fremstilling af agarose, suspendere 3 g SeaPlaque agarose i et totalvolumen på 100 ml destilleret vand (3% vægt / volumen) i en glasflaske. Autoklavér i 20-30 min. (Hvis agarose allerede blev fremstillet før hånd, re-smeltende agarose i mikrobølgeovn.) Det er vigtigt at ækvilibrere SeaPlaque agarose til 42 ° C i et vandbad før brug, fordi hvis agarosen er for varmt, vil det dræbe cellerne. Sørg for vandstanden er lig med eller over niveauet af agarosen at undgå uønsket størkning. Til fremstilling af de medier: at 100 ml 2x MEM-medium, som består af2x MEM, 10% (volumen / volumen) lavt endotoksin føtalt bovint serum (<10 eu >

Discussion

Plaque assay fremgangsmåde til MNV-1 præsenteret her er en måde at kvantificere infektiøse MNV partikler. Ved at følge analysetrin illustreret i figur 3, kan man opnå reproducerbare virale titere. Detektionsgrænsen for assayet afhænger af udgangsmaterialet anvendte fortynding. Ved start med en 1:10 fortynding af prøven, som beskrevet ovenfor, detektionsgrænsen af plaqueanalyse er 10 pfu (dvs., 1 plaque er synlig ved 10 ^-1 fortynding). Da hver plaque repræsenterer en enkelt virus kan plaqueanalyse også anvendes til at oprense klonale populationer af MNV ved at udvælge isolerede plaques og plantemateriale dem som beskrevet tidligere ^1. Desuden kan plakoprensninger også anvendes til at adskille en individuel viruspopulationen fra blandede viruspopulationer. En begrænsning ved anvendelse af et plaque-assay til påvisning af MNV infektion er, at ikke alle MNV stammer danne plaques ^4. Det kan imidlertid være muligt at overvinde inability af nogle MNV-stammer, isoleret fra dyr, til dannelse af plaks ved serievis passage disse virus i vævskultur ^7. Et alternativ til plaqueanalyse er at måle infektiøse partikler via _TCID50 teknikken ^{3, 4.} Dette assay kvantificerer mængden af virus krævet for at producere CPE i 50% af inokulerede vævskulturceller efter endpoint fortyndinger og tager en uge at fuldføre for MNV ^4. Ud over at være langsommere end en plaque-assay er _{TCID50-assayet} endvidere ikke så følsomme (detektionsgrænse = 200 _TCID50 / ml) på grund af toksiciteten af vævsprøver til RAW 264.7-celler ^fire.

Selvom kritiske skridt i protokollen er blevet beskrevet i hele protokollen følgende afsnit indeholder et resumé for at lette fejlfinding. Det mest kritiske trin i protokollen er at sikre, RAW 264.7-celler forbliver levedygtige hele assayet til at understøtte virusreplikation. Dette kanovervåges på hvert trin af assayet via lysmikroskopi. Cellelevedygtighed sikres på to måder. Først skal man være opmærksom på ikke at lade cellerne tørre ud, mens håndtering af plader. Således er pladerne inokuleret én ad gangen, rystet under infektionen tidsrum, og skal forblive lukket, når de ikke håndteres. For det andet, løsninger tilføjet på celler skal afbalanceres til ~ 37 ° C. Desuden er det afgørende for den generelle sundhed i RAW 264,7 celler til at opretholde dem i medier indeholdende lav endotoxin serum (<10 EU / ml), hvilket begrænser aktivering af celler. Derudover har vi observeret en højere fejlrate af plaqueanalyse ved anvendelse af celler fra passage 30 eller højere. Selv om dette sandsynligvis vil variere fra laboratorium til laboratorium, er det vigtigt at inkludere en positiv kontrol (fx en prøve med en kendt viral titer) for at sikre reproducerbare titere, navnlig når der anvendes højere passage RAW 264.7-celler. For at begrænse anvendelse af højere passage-celler, er det tilrådeligt at fastfryse hætteglas med tidlig Passage celler efter modtagelsen af ​​RAW 264,7 celler og starte en ny kultur fra de frosne hætteglas ofte. Start forfra med lavpassage cellekulturer vil også være nyttigt, når cellerne udviser ændrede egenskaber, såsom manglende overholdelse af, ændringer i cellemorfologi (fx fra runde til ranglet og sprede ud), eller når forurening med mycoplasma er blevet opdaget. Et andet vigtigt punkt at være opmærksom på er at sikre, at pipettespidserne skiftes mellem prøverne og i fortyndinger. Dette vil sikre nøjagtige seriefortyndinger og forhindre krydskontaminering mellem prøverne. Den ene trin i protokollen, hvor samme pipettespidsen kan bruges igen, er, når seriefortyndinger af den samme prøve sættes til brøndene. I så fald bør man starte fra den mest fortyndede inokulum til den mindste, og energisk pipetteres op og ned i forbindelse med udarbejdelsen af ​​en ny fortynding.

Plaque assayprotokollen kan ændres for flere modifikationer. Én modifikation, der kan foretages, når tHer er ikke nok celler til inokulering brønde in duplo, er at inokulere kun en enkelt brønd for hver fortynding. Eftersom inoculum volumen er 0,5 ml, antallet af plaques derefter skal multipliceres med en faktor på 2 omsætter til pfu / ml. Plak-assayet kan også tilpasses til anvendelse med andre adhærerende cellelinje der er i stand til at understøtte replikation af MNV, og dette er blevet beskrevet for det murine microglial BV-2 cellelinien ^8. Andre modifikationer, som kan gennemføres, er tilpasninger, der er blevet beskrevet til plaqueanalyse protokoller udviklet for andre vira. Ved MNV er følgende modifikationer allerede gennemført med held, anvendelsen af methylcellulose i stedet for Sea Plaque agarose ^9, og farvning af cellerne med krystalviolet eller methylenblåt i stedet for neutralt rødt ^{10, 11.}

Generelt kan denne protokol nemt tilpasses efter behov for at kvantificere andre plakdannende vira eller anvendes til othøh virus, der forårsager lytiske infektioner i RAW 264,7 celler, hvilket gør det til et nyttigt redskab til at kvantificere infektiøse viruspartikler i almindelighed.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010
10 mM Non-essential amino acids	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine	Hyclone	SH30034.01
Fetal Bovine Serum	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose	Lonza	50100
Neutral Red 0.33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Magna Lyser Instrument	Roche	03358968001
Raw 264.7 cell line	ATCC	TIB-71
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC