Placa de Ensayo para Norovirus murino

Summary

Aquí se describe un método para cuantificar las partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que es el norovirus que sólo se replica de manera eficiente en cultivo celular. El ensayo de placa se aprovecha de MNV tropismo para macrófagos murinos y puede ser adaptado para su uso con muestras biológicas o ambientales que contienen MNV.

Abstract

Norovirus murino (MNV) es el único miembro del género Norovirus que crece de manera eficiente en cultivo de tejido ^{1, 2.} La lisis celular y efecto citopático (CPE) se observan durante MNV-1 infección de las células dendríticas o macrófagos murinos ^1. Esta propiedad de MNV-1 puede ser usado para cuantificar el número de partículas infecciosas en una muestra determinada mediante la realización de un ensayo de placa ^1. La placa de ensayo se basa en la capacidad de MNV-1 para lisar las células y para formar agujeros en una monocapa confluente de células, que se denominan placas ^3.

Múltiples técnicas se pueden utilizar para detectar infecciones virales en el cultivo de tejidos, tejido recogido, clínica, y muestras ambientales, pero no todos medida el número de partículas infecciosas (por ejemplo, QRT-PCR). Una manera de cuantificar partículas virales infecciosas es llevar a cabo un ensayo de placa ^3, que se describirá en detalle a continuación. Una variación en el ensayo de placas MNV es el flúorensayo de foco escent, donde se inmunotiñeron antígeno MNV en monocapas de células ^4. Este ensayo puede ser más rápido, ya que la expresión del antígeno viral precede a la formación de placa. También es útil para valorar los virus incapaces de formar placas. Sin embargo, el ensayo de foco fluorescente necesita recursos adicionales a los de la placa de ensayo, tales como anticuerpos y un microscopio para contar las unidades formadoras de foco-. Infecciosa MNV también se puede cuantificar mediante la determinación de la Cultura 50% de tejido dosis infecciosa (TCID ₅₀₎ ^3. Este ensayo mide la cantidad de virus requerida para producir CPE en 50% de las células de cultivo de tejidos inoculados mediante valoración de punto final ^5. Sin embargo, su límite de detección es mayor en comparación con un ensayo de placa ^4.

En este artículo, se describe un protocolo de ensayo de placa que se puede utilizar para determinar efectivamente el número de partículas infecciosas de MNV presentes en muestras biológicas o ambientales ^{1, 4, 6.} Este método es based en la preparación de 10-veces diluciones seriadas de MNV muestras que contienen, que se usan para inocular una monocapa de células permisivas (RAW 264,7 macrófagos murinos). Virus se le permite adjuntar a la monocapa de células durante un período determinado de tiempo y luego aspirado antes de cubrir las células con una mezcla de agarosa y medios de cultivo celular. El agar permite la propagación de la progenie viral a las células vecinas mientras que limita la propagación de las células situadas alejadas. Por consiguiente, las células infectadas se lisaron y se forman agujeros en la monocapa conocida como placas. Tras la propagación de virus suficiente, las placas convertido en manchas visibles siguiente de las células con tintes, tales como rojo neutro, azul de metileno, o violeta cristal. A diluciones bajas, cada placa se origina a partir de una partícula infecciosa viral y su progenie, que se extendió a las células vecinas. Así, contando el número de placas permite calcular unidades formadoras de placas (PFU) presentes en la muestra sin diluir ^3.

Protocol

1. El cultivo de la línea celular de macrófagos RAW 264,7 Mantener células RAW 264,7 (ATCC, catálogo # TIB-71) en DMEM-10 medios de comunicación, que consiste en glucosa elevada DMEM con 10% (v / v) de baja endotoxina de suero bovino fetal (<10 eu > Nota: es recomendable tener varias botellas con autoclave SeaPlaque agarosa preparado con anticipación. La agarosa se puede volver a fundir en un horno de microondas antes de su uso. Calcular la cantidad de superposición necesaria para el volumen total de las placas antes de la incubación de 1 h se completa. El volumen necesario es 2 ml / pocillo o placa 12 ml/6-well. Preparar agarosa (ver sección 3.2) y los medios (ver sección 3.3) por separado. Para preparar la agarosa, suspender 3 g de agarosa SeaPlaque en un volumen total de 100 ml de agua destilada (3% w / v) en una botella de vidrio. Autoclave durante 20-30 min. (Si agarosa ya estaba preparada de antemano, re-fusión de agarosa en el microondas.) Es importante equilibrar SeaPlaque agarosa a 42 ° C en un baño de agua antes de su uso, porque si la agarosa es demasiado caliente, que matará a las células. Asegúrese de que el nivel de agua es igual o por encima del nivel de la agarosa para evitar la solidificación no deseada. Para preparar los medios de comunicación: hacer 100 ml de 2x MEM medios de comunicación, que consiste2x MEM, 10% (v / v) de baja endotoxina de suero bovino fetal (<10 eu >

Discussion

El método de ensayo de placa para MNV-1 se presenta aquí es una forma de cuantificar partículas infecciosas de MNV. Siguiendo los pasos del ensayo se ilustra en la Figura 3, se puede obtener reproducibles títulos virales. El límite de detección del ensayo depende de la dilución de partida utilizado. Cuando comenzando con una dilución 1:10 de la muestra como se describe anteriormente, el límite de detección del ensayo de placa es de 10 ufp (es decir, 1 placa visible en la dilución 10 ^-1). Dado que cada placa representa un solo virus, el ensayo en placa también se puede utilizar para purificar poblaciones clonales de MNV recogiendo placas aisladas y propagar ellos como se ha descrito anteriormente ^1. Además, purificaciones en placa también se puede utilizar para separar una población de virus individuales de poblaciones de virus mezclados. Una limitación del uso de un ensayo de placa para la detección de infección MNV es que no todas las cepas MNV formar placas ^4. Sin embargo, puede ser posible superar la inability de algunas cepas MNV, aisladas de animales, para formar placas por pases en serie estos virus en cultivo de tejido ^7. Una alternativa a la placa de ensayo es medir partículas infecciosas a través de la técnica de TCID ₅₀ ^{3, 4.} Este ensayo cuantifica la cantidad de virus necesaria para producir CPE en 50% de las células de cultivo de tejidos inoculados tras diluciones de punto final y toma 1 semana para completar para MNV ^4. Además de ser más lento que un ensayo en placa, el ₅₀ TCID ensayo es también no es tan sensible (límite de detección = 200 TCID ₅₀ / ml), debido a la toxicidad de las muestras de tejido para células RAW 264,7 ^4.

A pesar de los pasos críticos dentro del protocolo se han descrito en todo el protocolo, la siguiente sección se ofrece un resumen para facilitar la resolución de problemas. El paso más crítico en el protocolo es asegurar que RAW 264,7 células permanecen viables durante todo el ensayo para apoyar la replicación del virus. Esto puedeun control en cada etapa del ensayo a través de microscopía de luz. La viabilidad celular se garantiza de dos maneras. En primer lugar, se debe tener cuidado de no permitir que las células se secan durante la manipulación de placas. Por lo tanto, las placas se inoculan uno a la vez, sacudió durante el período de infección, y debe permanecer cerrado cuando no están siendo manejados. En segundo lugar, las soluciones de añadirse a las células deben equilibrarse a ~ 37 ° C. Además, es vital para la salud general de las células RAW 264,7 para su mantenimiento en medios que contienen suero de endotoxina bajo (<10 EU / ml), lo que limita la activación de las células. Además, hemos observado una mayor tasa de fracaso de la placa de ensayo utilizando las células de pasaje 30 o superior. Aunque esto probablemente variará de un laboratorio a otro, es importante incluir un control positivo (por ejemplo, una muestra con un título viral conocida) para asegurar títulos reproducibles, especialmente cuando se utilizan mayores pasaje células RAW 264,7. Para limitar el uso de células de paso superior, es aconsejable para congelar viales de principios passage células a la recepción de RAW 264,7 células y comenzar una nueva cultura de los viales congelados con frecuencia. Empezar de nuevo con bajas culturas pasaje celular también será útil cuando las células presentan características alteradas, tales como la falta de adhesión, los cambios en la morfología celular (por ejemplo, de redonda a larguirucha y hacia fuera), o cuando la contaminación por micoplasmas se ha detectado. Otro punto importante prestar atención a es asegurar que las puntas de pipeta se cambian entre las muestras y durante las diluciones. Esto asegurará precisos diluciones en serie y evitar la contaminación cruzada entre las muestras. El primer paso en el protocolo donde se encuentra la punta de la pipeta mismo es utilizado de nuevo cuando diluciones en serie de la misma muestra se añaden a los pocillos. En ese caso, hay que comenzar desde el inóculo más diluido a lo menos, y vigorosamente pipetear hacia arriba y abajo en la elaboración de una nueva dilución.

El protocolo de ensayo de placa es enmendable de varias modificaciones. Una modificación que puede hacerse cuando taquí no son suficientes células para la inoculación de los pocillos por duplicado es inocular sólo un único pocillo de cada dilución. Sin embargo, puesto que el volumen del inóculo es 0,5 ml, el número de placas luego tiene que ser multiplicado por un factor de 2 para normalizar a pfu / ml. El ensayo en placa también se puede adaptar para su uso con cualquier otra línea celular adherente que es capaz de soportar la replicación de MNV, y esto se ha descrito para la línea de murino microglial BV-2 de células ^8. Otras modificaciones que se pueden aplicar son adaptaciones que se han descrito para los protocolos de la placa de ensayo desarrollados para otros virus. En caso de MNV, las siguientes modificaciones ya se han aplicado con éxito, el uso de celulosa de metilo en lugar de agarosa Sea Plaque ^9, y la tinción de las células con cristal violeta o azul de metileno en lugar de rojo neutro ^{10, 11.}

En general, este protocolo se puede adaptar fácilmente según sea necesario para cuantificar otras formadoras de placas o virus utilizado para OTHer los virus que causan las infecciones líticas en RAW 264,7 células, lo que hace que sea una herramienta útil para cuantificar partículas virales infecciosas en general.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DMEM/ High glucose	Hyclone	SH30243.02
2x MEM	Gibco	11935
100x Penicillin and streptomycin	Hyclone	SV30010
10 mM Non-essential amino acids	Hyclone	SH30238.01
1M HEPES	Hyclone	SH30237.01
200 mM (100x) L-glutamine	Hyclone	SH30034.01
Fetal Bovine Serum	Gibco, Hyclone	10437, SH30070.02
Sea Plaque Agarose	Lonza	50100
Neutral Red 0.33%	Sigma	N2889
1x PBS	Gibco	10010
1.0 mm Zirconia/Silica beads	BioSpec Products	11079110z
Model 35 Speed Rocker	Labnet	S2035
Magna Lyser Instrument	Roche	03358968001
Raw 264.7 cell line	ATCC	TIB-71
Tissue culture incubator	Sanyo	MCO-18AIC