호흡과 산화 인산화와와 세포 생존에 관련된 mitochondrial 기능에 단백질 키나제 C (PKC) isozymes의 활성화 효과가 설명되어 있습니다. 접근 방식은 선택적으로 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 결정하는 주요 세포 배양 및 assays의 다양한 PKC isozymes을 overexpress하는 adenoviral 기술을 적응.
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방법 논문
신장 세포 Overexpressing 단백질 키나제 C Isozymes에 Mitochondrial 기능 및 세포 생존 능력의 평가
이 논문에서
요약
초록
isozymes의 단백질 키나제 C (PKC) 가족 여러 생리 학적 및 병리학 과정에 참여하고 있습니다. 최근 데이터는 PKC는 mitochondrial 기능과 세포의 에너지 상태를 조절하는 보여줍니다. 많은 보고서는 PKC-a와 PKC-ε의 활성화는 허혈성 심장과 mediates의 cardioprotection에서 mitochondrial 기능을 향상 보여 주었다. 반면에, 우리는 PKC-α와 PKC-ε은 신장 세포에서 nephrotoxicant 유발 mitochondrial 장애 및 세포 죽음에 연루되어 보여주고 있습니다. 따라서, 본 연구의 목표는 PKC의 isozymes가 선택적으로 활성화 또는 산화 인산화와 세포 생존의 규정에서 자신의 역할을 결정하기 위해 저해 할 수있는 활성 mitochondrial 기능을 유지하는 신장 세포의 체외 모델을 개발하는 것이 었습니다. 신장 근위 관 세포 (RPTC)의 기본 문화는 미토의 mitochondrial 호흡과 활동의 결과로 개선 된 조건에서 배양 된생체 내 RPTC에서 비슷한 chondrial 효소. 전통 transfection 기술 (Lipofectamine, electroporation)가 기본 문화에 비효율적이며, mitochondrial 기능에 부정적 영향을 미칠 때문에, PKC-ε 돌연변이 cDNAs가 adenoviral 벡터를 통해 RPTC에게 전달했다. % 90 교양 RPTC의 transfection에있는이 방법은 결과를 표시합니다.
여기, 우리는에서 PKC-ε의 역할을 평가하기위한 방법을 제시 1. mitochondrial 형태와 ATP 합성, 2와 관련된 기능을 규제. 차 문화에 RPTC의 생존. PKC-ε는 overexpressing constitutively 활성화 PKC-ε 돌연변이에 의해 활성화됩니다. PKC-ε는 overexpressing에 의해 PKC-ε의 비활성 돌연변이를 억제하고 있습니다. Mitochondrial 기능, 호흡 단지 및 활동을 호흡기 체인의 무결성을 호흡을 검토하여 평가된다 F 0 F 1 ATPase, ATP 생산 속도, 및 ATP의 콘텐츠입니다. 호흡은주 3 일 (초과 기판과 ADP의 존재의 최대 호흡)와 uncoupled 호흡으로 digitonin-permeabilized RPTC에 ssessed. 호흡기 체인의 무결성은 절연 된 미토콘드리아의 호흡 체인의 네 가지 단지의 활동을 측정하여 평가된다. 산화 인산화의 용량은 F 0 F 1 ATPase의 ATP 생산 속도, 활동, mitochondrial 막 잠재력을 측정하여 평가됩니다. RPTC의 에너지 상태가 세포 내 ATP 내용을 결정함으로써 평가된다. 라이브 셀의 Mitochondrial 형태는 MitoTracker 레드 580, 특히 미토콘드리아에 축적 형광 염료, 라이브 monolayers 형광 현미경으로 검사 아르를 사용하여 시각화합니다. RPTC 가능성은 annexin V / apoptosis 및 oncosis을 결정하는 유동 세포 계측법에 이어 propidium의 요오드화물 착색를 사용하여 평가된다.
이러한 방법은 각각의 PKC isozymes의 선택적 활성화 / 억제 할 수 있도록체외의에 복제 할 수 있습니다 생리학 및 병리학 조건 다양한 세포 기능에서 자신의 역할을 평가합니다.
프로토콜
1. 차 문화 신장 근위 Tubules의 절연
- 토끼, 소비세 모두 신장을 마취하고 층류 후드의 무균 시험을 치루 버퍼 (DMEM/F12 매체)로 가득 찬 페트리 접시에 배치합니다.
- 멸균 50 ML에 이어 사립 버퍼의 50 ML 각 신장을 Perfuse 생리, 산도에게 7.4 (PBS)를 인산염은 버퍼, 그리고 PBS 철 산화물 솔루션 (45 ML + 5 ML). 신장을 드 - capsulate와 deferoxamine를 포함하는 사립 버퍼로 전송할 수 있습니다.
- 각 신장의 피질을 수확.
- 15 ML 다운스 호 모지 나이저를 사용하여 조직을 균질화. 1 L 멸균 비이커 위에 위치 2 무균 메쉬 sieves (바닥에 85 μm 및 상단에 235 μm)를 통해 homogenate 하거라. deferoxamine 함유 버퍼로 sieves를 씻어.
- deferoxamine 함유 버퍼의 35-40 ML로 가득 살균 원뿔 원심 분리기 관에 85 μm의 체에 남아있는 조직을 수집합니다. 부드럽게 세포 현탁액을 섞는다.
- 강력한 m를 배치관의 외부 agnet는 glomeruli을 가득 철을 제거하고 정지 정착하게합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 자석에서 철을 대기음. 이 과정을 반복합니다.
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결과
그림 1 프로그램 그 adenoviral 전달 RPTC와 미토콘드리아에서 PKC-ε의 크게 증가 단백질 수준에서 PKC-ε 결과의 constitutively 활성 (caPKC-ε)과 비활성 (dnPKC-ε) 뮤턴트 코딩 cDNA. 세포가 비활성화했습니다 cDNA 코딩 dnPKC을 ε overexpressed PKC-ε (phosphorylated되지 않음) (그림 1)에 감염된 반면 caPKC-ε 벡터를 들고 cDNA에 감염된 세포는 PKC-ε의 phosphorylated (활성) 양식을 overexpressed. 활성의 존재는 PKC-ε PKC-ε 비활성 아무 효과 (그림 2) 없다고 반면, 미토콘드리아 에너지를하는 데 사용되는 기판에 관계없이 RPTC에 mitochondrial 호흡을 감소. 호흡 사슬에서 PKC-ε 활성의 목표를 결정하기 위해, 우리는 호흡 사슬의 모든 효소 복합체의 활동을 결정. 그림 3에
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토론
여기에 제시된 방법은 신장 근위 관 세포의 주요 문화에 PKC의 개별 isozymes의 overexpression 할 수 있습니다. 이 방법의 몇 가지 장점이 있습니다 : 1. 그것은 다양한 모욕 (국소 빈혈, hypoxia, 산화 스트레스), 약물, 그리고 신장에서 nephrotoxicants의 기본 목표 아르 셀 (신장 근위 관 세포)의 동질적인 인구 규제 메커니즘을 조사 할 수 있습니다. 2. 개선 된 조건에서 차 문화에서 자란 RPTC의 체외 모델에서의 Mitochondrial 기능은 생체 내 신장 근위 tubules의 mitochondrial 기능과 유사. 1,2 3. 체외 모델이 서로 다른 toxicants에 미토콘드리아의 반응은 생체 내 신장 근위 tubules의 반응과 비슷합니다. 4. 이 방법은 신호 전달 mechani에 관여 단백질 등의 특정 단백질을 코딩 유전자의 효율적인 transfection 및 배달이 가능mitochon.......
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공개 사항
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 보건원, 국립 당뇨병 연구소와 소화기 및 신장병, 2R01DK59558 (GN까지)에서 보조금에 의해 지원되었다. 연구 자료 보조금 UL1 RR029884을위한 건강 국립 센터의 국립 연구소에 의해 지원 UAMS 병진 연구소 UAMS에서 유동 세포 계측법 코어의 일부 자금을 제공했습니다. 우리가 고마워 박사 Peipei 핑 (로스 앤젤레스 캘리포니아 대학, 로스 앤젤레스, CA) cDNA PKC-ε 박사 알렌 Samarel (로욜라 메리 대학 의료 센터의 지배적 부정적 (비활성) 돌연변이 코딩 휴대 아데노 바이러스의 나누어지는를 제공, PKC-ε의 constitutively 활성화 돌연변이 코딩 adenoviral 벡터의 나누어지는를 제공 Maywood, IL). 우리는 또한 Drs 감사드립니다. PKC-ε constitutively 활성화 cDNA 코딩을 제공하는 피터 파커와 피터 Sugden (임페리얼 칼리지 런던, 런던, 영국).
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재료
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| 2 ML 15 ML의 다운스 호 모지 조직 연삭기 | 휘튼 | 989-24607, 357,544 | |
| 85 235 마이크론 나일론 메쉬 | 소형 부품 | CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD | |
| 50 ML 멸균 원심 분리기 관 | BIOLOGIX | BCT-P 50BS | |
| 1.5 ML 마이크로 튜브 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 35 X 10mm 멸균 문화 요리 | 코닝 | 430165 | |
| 주앙의 원심 분리기 | 주앙 | 주앙 CR3 11,175,704 회 전자 : 주앙 T40 | |
| 조절 마이크로 원심 분리기 | 시그마 | 모델 1-15 | |
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| DMEM / F12 햄 | 시그마 | D 2906 - 1L | |
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| Collagenase 유형 I | 워싱턴 | 4196 | |
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| Mitotracker 레드 | Invitrogen | M22425 | |
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참고문헌
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorb....
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