Een nieuwe methode voor de cultuur en de gepolariseerde Stimulatie van Human darmslijmvlies Explantaten
Summary
We stellen een nieuwe werkwijze voor het onderhoud van menselijke intestinale mucosa in cultuur en controle van de reactie op verschillende soorten stimuli gedurende tenminste 24 uur. Bij onze werkwijze, wordt de polariteit van het weefsel gehandhaafd, waardoor een fysiologische stimulering via de apicale route.
Abstract
Enkele modellen die nu bestaan om realistisch te simuleren van de complexe menselijke darm micro-omgeving, waar een verscheidenheid aan interacties plaatsvinden. Juiste homeostase direct afhankelijk van deze interacties als ze vormen een volledige immunologische respons induceren van tolerantie tegen voedsel antigenen, terwijl tegelijkertijd montage effectieve immuunrespons tegen pathogene microben ongeluk wordt ingenomen met voedsel.
Intestinale homeostase is ook bewaard gebleven door middel van verschillende complexe interacties tussen de microbiota (inclusief voedsel-geassocieerde gunstige bacteriestammen) en de gastheer, die de bevestiging / degradatie van slijm te regelen, de productie van antimicrobiële peptiden door de epitheliale barrière, en de "opvoeding" van epitheelcellen bevolking 'dat de tolerogene of immunogene fenotype van unieke, darm-resident lymfecellen bestuurt'. Deze interacties zijn tot dusver zeer moeilijk te reproduceren met in vitro assaysbehulp van gekweekte cellijnen of perifere mononucleaire bloedcellen. Bovendien muismodellen aanzienlijk verschillen in bestanddelen van het darmslijmvlies (slijmlaag organisatie commensaalbacteriën gemeenschap) ten opzichte van de menselijke darm. Aldus hebben studies van verschillende behandelingen te brengen in de klinieken voor belangrijke stress of pathologische aandoeningen zoals prikkelbare darmsyndroom, inflammatoire darmziekte of colorectale kanker moeilijk uitvoerbaar zijn.
Om deze problemen aan te pakken, hebben we een nieuw systeem dat ons in staat stelt om explantaten van het menselijk darmslijmvlies dat hun in situ conditionering behouden door de gastheer microbiota en de immuunrespons te stimuleren, in een gepolariseerde fashion ontwikkeld. Gepolariseerde apicale stimulatie is van groot belang voor het resultaat van de opgewekte immuunreactie. Het is herhaaldelijk aangetoond dat dezelfde stimuli produceren totaal verschillende reacties wanneer en passeren apicale oppervlak van de intestinale epithelium, het stimuleren van epitheelcellen basolateraal of die in direct contact met de lamina propria onderdelen, schakelen het fenotype van tolerogene tot immunogeen en het veroorzaken van onnodige en overmatige ontsteking in het gebied.
We bereikten gepolariseerd stimulatie door lijmen een grot cilinder die afgebakend het gebied van stimulatie op de apicale gezicht van het slijmvlies zoals zal in het protocol worden beschreven. We gebruikten dit model te onderzoeken, onder meer differentiële effecten van drie verschillende Lactobacilli stammen. We tonen aan dat dit model systeem is zeer krachtig om de immunomodulerende eigenschappen van probiotica te beoordelen bij gezonde en aandoeningen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De behoefte aan fysiologisch relevante modellen waarop behandelingen voor menselijke darmslijmvlies geldig kan worden getest is lang benadrukt. Veel onderzoekers hebben potentiële artefacten en geïdentificeerd in zowel cel 5 en muismodellen 6 tot dusver voor dat doel gebruikt. Sterker nog, ook al veelbelovende preklinische gegevens wordt vaak verkregen, deze zelden te vertalen naar significant klinisch voordeel.
De methode in dit werk beschreven, geeft een relatief ee…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Erika Mileti voor een uitstekende technische ondersteuning en Dr Antonio Di Sabatino voor het verstrekken van zuurstof kamers.
Financiering: Dit werk werd ondersteund door subsidies van het 7e EU-kaderprogramma (IBDase, ERC: Dendroworld) en Fondazione Cariplo naar MR en ondersteuning door een Marie Curie internationale opleiding mobiliteit netwerk (Cross-Talk, subsidieovereenkomst nr: 21553-2) naar KT.
Materials
| Regeant | Company | Catalog No. | |
| Reagents | |||
| 10X HBSS | Eurocalne | ECM4006XL | |
| Peni/Strepto | Lonza | DE17602E | |
| Gentamycin | Gibco | 15750-037 | |
| DMEM | Lonza | BE12614 | |
| FBS-Na | Gibco | 16000-044 | |
| 100X ITS-X | Gibco | 51500-056 | |
| EGF | Tebu-bio | 100-15 | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17605E | |
| Non essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-035 | |
| NaPyr | Gibco | 11360-039 | |
| Materials | |||
| Cloning cylinders 6×8 mm | BellCo | 2090-00608 | |
| Cloning cylinders 8×8 mm | BellCo | 2090-0080 | |
| Cloning cylinders 10×10 mm | BellCo | 2090-01010 | |
| Metal grids | Home made | ||
| Centre well organ culture plate | BD Falcon | 353037 | |
| Surgical glue (Vetbond) | 3M | 1469SB | |
| Oxygen Jars | Home made | ||
| Oxygen tanks | Air Liquid Sanità |
References
- Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection. Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).
- Tsilingiri, K., et al. Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model. Gut. , (2012).
- Tsilingiri, K., Rescigno, M. Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?. Gut Microbes. , (2012).
- Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy. PLoS One. 4, e7056 (2009).
- Cencic, A., Langerholc, T. Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology–a review. Int. J. Food Microbiol. 141, S4-S14 (2010).
- te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis. Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).
- Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture. J. Anat. 134, 459-469 (1982).
- Browning, T. H., Trier, J. S. Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine. J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).
- Besselink, M. G., et al. Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 371, 651-659 (2008).
- Lakhdari, O., et al. Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356 (2011).
