Массовые цитометрии: Протокол для ежедневного настройка и запуск образцы клеток на Цитометр массовой CyTOF
Summary
Шаги, необходимые для ежедневной настройки и оптимизации производительности цитометр массы CyTOF описаны. Комментарии по оптимальной подготовки проб и расхода обсуждается
Abstract
В последние годы быстрый анализ отдельных клеток имеет обычно были выполнены при помощи проточной цитометрии и флуоресцентной-меченых антител. Тем не менее, вопрос о спектрального перекрытия флуорофора выбросы ограничивает количество одновременных зондов. В отличие от нового массового CyTOF цитометр от DVS наук пары жидкости одноклеточных внедрение системы ICP-MS. 1, а не флуорофоры, хелатирующие полимеров, содержащих высоко обогащенный изотопами металлов связаны с антителами или других специфических зондов. 2-5 В связи с чистотой металла и масса разрешение масса цитометр, нет "спектрального перекрытия" из соседних изотопов и, следовательно, нет необходимости в компенсации матриц. Кроме того, благодаря использованию лантаноидов металлов, не существует биологический фон и, следовательно, нет эквивалента автофлуоресценции. С массой окна охватывающих атомной массой 103-203, теоретически до 100 этикеток можно было различить одновременно. В настоящее время, Более 35 каналов доступны при использовании хелатирующих реагентов можно получить DVS наук, что позволяет беспрецедентный рассечение иммунологического профиля образцов. 6-7
Недостатки массовой цитометрии включают строгие требования к отдельным изотоп металла на зонд (нет эквивалента вперед или боковой разброс), а также тот факт, что она является разрушительной техники (без возможности восстановления сортировка). Текущая конфигурация массы цитометр также имеет скорость ячеек передачи только ~ 25%, что требует более высокого входного числа клеток.
Оптимальная ежедневная производительность массы цитометр требует нескольких этапов. Основная цель оптимизации заключается в максимизации измерений интенсивности сигнала нужного металла изотопов (M) при минимизации образования оксидов (M +16), что приведет к снижению M интенсивности сигнала и мешать любым сигнал на M +16. Первый шаг, чтобы разогреть машину таким горячим, стабильный яCP плазма была создана. Во-вторых, настройки для текущего и макияж расхода газа должны быть оптимизированы на ежедневной основе. Во время отбора проб, максимальная скорость событие ячейки ограничен эффективности детектора и скорость обработки до 1000 клеток / сек. Однако, в зависимости от качества образца, медленнее, клетки события (300-500 клеток / секунду), как правило, желательно, чтобы лучше разрешение между клетками событий и, таким образом максимально нетронутым синглеты более дублетов и мусора. Наконец, адекватная очистка машины в конце рабочего дня помогает минимизировать фонового сигнала из-за свободного металла.
Protocol
Representative Results
Discussion
За последние несколько десятилетий, флуоресценция проточной цитометрии была рабочая лошадка метод анализа отдельных клеток, как с точки зрения поверхностной экспрессии и функционального анализа. Тем не менее, вопросы спектрального перекрытия флуоресцентных красителей имеет ограни?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-р Эван Ньюэлл и д-р Шон Бендалл для обратной связи. Мы также хотели бы поблагодарить DVS наук и доктора Шона Бендалл для образца Multi-лантанидов содержащих гранул полистирола. Мы благодарны за финансирование NIH грант от 2 до 19 лет AI057229.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| CyTOF mass cytometer | DVS Sciences | ||
| Wash solution | DVS Sciences | 201071 | 0.05% hydrofluoric acid in water |
| Tuning solution | DVS Sciences | 201072 | 0.5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, trace nitric acid |
| Eu-containing polystyrene beads | DVS Sciences | 201073 | Contains natural-abundance Eu isotopes; beads supplied at approximately 1 million/ml |
| Multi-lanthanide-containing (La/Pr/Tb/Tm/Lu)- polystyrene beads | DVS Sciences | Not yet commercially-available | Contains natural-abundance isotopes of listed lanthanides |
| Nitric acid (concentrated) | Fisher Scientific | A467-500 | Optima trace-metal pure ICP-MS grade |
| Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap-5 ml | BD | 352235 | used to filter cell samples before injection |
| Norm-Ject tuberkulin syringe-1 ml | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | silicone-free, latex-free |
| Norm-Ject syringe-3 ml | Henke Sass Wolf | 4010.000V0 | silicone-free, latex-free |
| MilliQ water | 18 MΩ pure water; must not be stored in glass or plastic bottles that have been washed with commercial detergent (due to their high levels of barium present). | ||
| Citranox | Sigma-Aldrich | Z273236 | acid detergent |
| Argon gas | Praxair | AR 5.0UH-T | 99.999% Ultra-high purity |
References
- Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
- Lou, X. Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays. Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).
- Majonis, D. Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain. Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).
- Leipold, M. D. Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).
- Bendall, S. C. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Newell, E. W. Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes. Immunity. 36, 142-152 (2012).
