إضافة إلى عكسها من بالميتات البروتينات مهم المنظم الاتجار البروتين داخل الخلايا. هذا هو موضع اهتمام خاص في الخلايا العصبية حيث يتم palmitoylated البروتينات متشابك كثيرة. نحن نستخدم طريقة بسيطة للكشف عن البروتينات الحيوية palmitoylated في الخلايا العصبية مثقف، والتي يمكن تكييفها لأنواع الخلايا والأنسجة المتعدد.
Palmitoylation هو تعديل المادة الدهنية في مرحلة ما بعد متعدية ينطوي على إلحاق حمض الكربون 16-الدهنية المشبعة، بالميتات، إلى بقايا السيستين من البروتينات الركيزة من خلال السندات thioester عطوب [مشاركة في 1]. Palmitoylation من البروتين يزيد hydrophobicity الركيزة لها، ويسهل عادة الاتجار تجاه الأغشية الخلوية. وقد أظهرت الدراسات الحديثة palmitoylation ليكون واحدا من التعديلات الدهون الأكثر شيوعا في الخلايا العصبية 1، 2، مما يدل على أن معدل دوران بالميتات هو آلية هامة من هذه الخلايا التي تنظم الاتجار واستهداف البروتينات. يمكن تحديد والكشف عن ركائز palmitoylated تحسين فهمنا لذلك الاتجار البروتين في الخلايا العصبية.
وقد تم الكشف عن بروتين palmitoylation أعاقت في الماضي من الناحية الفنية نظرا لعدم وجود توافق في الآراء بين تسلسل بروتينات الركيزة، والاعتماد على الأيض labeliنانوغرام من بالميتويل-البروتينات مع 3 H-بالميتات، ومقايسة البيوكيميائية تستغرق وقتا طويلا مع انخفاض الحساسية. تطوير فحص الأسيل، البيوتين (ABE) تبادل تمكن أكثر سرعة وحساسية عالية الكشف البروتينات palmitoylated 2-4، وهو الأمثل لقياس دوران ديناميكية بالميتات على البروتينات العصبية. وتتألف الفحص ABE من ثلاث خطوات البيوكيميائية (الشكل 1): 1) الحصار لا رجعة فيه معدلة المجموعات ثيول السيستين باستخدام N-ethylmaliemide (NEM)، 2) الانقسام محددة وإماطة اللثام عن مجموعة السيستين palmitoylated في ثيول من هيدروكسيل (HAM)، و 3) وضع العلامات الانتقائي للالسيستين palmitoylated باستخدام كاشف biotinylation ثيول التفاعل، البيوتين، BMCC. تنقية البروتينات المعقدة البيروكسيديز ثيول-باتباع الخطوات ABE واختلف، وهذا يتوقف على الهدف العام المتمثل في التجربة.
هنا، نحن تصف طريقة لتنقية بروتين palmitoylated الاهتمام الأساسي hippocampالخلايا العصبية من قبل شركة مناعي الأولية (IP) الخاص خطوة جسم مضاد ضد البروتين، يليه فحص ABE والغربية النشاف لقياس مستويات palmitoylation مباشرة من هذا البروتين، الذي يسمى الفحص IP-ABE. تم منخفض الكثافة الثقافات من الخلايا العصبية قرن آمون الفئران الجنينية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة الترجمة، وظيفة، والاتجار بها البروتينات العصبية، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة الخلايا العصبية باستخدام البروتين palmitoylation الفحص IP-ABE. الفحص IP-ABE يتطلب أساسا IP القياسية والكواشف الغربية النشاف، ويقتصر فقط من قبل توافر أجسام مضادة ضد الركيزة الهدف. يمكن بسهولة أن تتكيف هذا الفحص للكشف عن وتنقية البروتينات palmitoylated بالنقل في مزارع الخلايا مغاير والثقافات العصبية الأولية المستمدة من مختلف أنسجة المخ كل من الماوس والفئران، وحتى الابتدائية أنسجة المخ نفسها.
الفحص IP-ABE المقدمة هنا هي طريقة بسيطة وحساسة للغاية للكشف عن البروتينات palmitoylated في الخلايا العصبية قرن آمون مثقف الابتدائي، وذلك باستخدام تقنيات الكيمياء الحيوية القياسية في الغالب. هذا يجعل الفحص التكيف بسهولة للمختبرات مجهزة بالفعل مع النشاف الغربية المواد. الفحص IP-ABE يجمع بين معيار بروتوكول مناعي لعزل البروتين وشل واحد هدف، تليها الكيمياء ABE موضح سابقا 2-4 للكشف بسرعة مستويات البروتين بالميتات على الركيزة. تقنية ABE لديها مجموعة واسعة من التطبيقات لدراسة البروتينات palmitoylated في الأنسجة المختلفة، وخطوط الخلايا، بما في ذلك الفحص بالميتويل-البروتين على نطاق واسع لمحات palmitoylation العالمية، والكشف السريع عن مستويات من البروتين palmitoylation هدف واحد.
وقد استخدمت الأوصاف السابقة للكيمياء مختلفة ABE تحلل الخلايا واستخراج الأساليب المنظفات من البروتوكول الاضافي العصبيةeins 2، 9، مجانا-ثيول الحصار 10 و 11 و biotinylation، وتنقية البروتين المستهدف 4، اعتمادا على تطبيق التجربة. وإضافة إلى نتائج بالميتات البروتينات العصبية في استهداف تجاه الأغشية الخلوية، والكشف عن جزء من بروتين palmitoylated الهدف يتطلب استخراجه من هذه الأغشية. وقد استخدمت منهجيات سبق وصفها ABE مجموعة متنوعة من 9 الأيونية والمنظفات غير الأيونية 8 إلى استخراج البروتينات الهدف المطلوب، واستخدام المنظفات خاصة تعتمد على البروتين المستهدفة والاتجار به غشاء المعروفة. هنا، ونحن الاستفادة من غير تغيير طبيعة والمنظفات غير الأيونية IGEPAL CA-630 لاستخراج البروتينات palmitoylated، التي لدينا لاستخراج والتحقق من صحة الكشف عن الخلايا العصبية palmitoylated catenin-δ البروتين (الشكل 2). هيكل IGEPAL CA-630 تضم مجموعة ضخمة وصلبة الرأس غير القطبية التي لاتعطيل البروتين التشكل الأصلية أو التفاعلات، ولكن الذي يسمح ارتباطه المناطق مسعور من البروتينات المرتبطة غشاء، وبالتالي منح امتزاج لهم والسماح لهم استخراج. يجب أن يكون استخراج البروتينات العصبية العديد مترجمة إلى الغشاء متشابك أو الكثافة بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي باستخدام IGEPAL CA-630، ولكن قد لا ذوبان بعض تماما، وربما تتطلب استخدام المنظفات غير يبدل طبيعة مختلفة مثل تريتون X-100، التي لديها استخدمت سابقا للكيمياء ABE 2 و 8.
وقد استخدمت العديد من الأوصاف الكيمياء ABE أيضا مختلفة كاشف biotinylation ثيول التفاعل جزيء من وصفنا هنا، ودعا البيوتين-HPDP (الحرارية العلمية)، وهو ما يتطلب أيضا وسائل مختلفة من البروتين تنقية 4. البيوتين-HPDP هو آخر ثيول التفاعل، جزيء البيوتين، مترافق maliemide الذي يحتوي على السندات ثاني كبريتيد في الذراع رابط maliemide، د هيكلياifferentiating أنه من البيوتين-BMCC، والتي لا تحتوي على هذه السندات ثاني كبريتيد. بعد biotinylation-ثيول من السيستين بروتين الحرة أو palmitoylated من البيوتين-HPDP، يمكن المشقوق السندات ثاني كبريتيد الناتجة بين البروتين المستهدفة والمجموعة البيوتين عن طريق الحد من الكواشف لاطلاق سراح مجموعة البيوتين وتجديد البروتين في صيغتها الغير معدلة، مما يجعل biotinylation من البيوتين-HPDP عابرة وقابلة للانتكاس. ولذلك، واستخدام هذا يتطلب تنقية كاشف biotinylation من البروتين المستهدف لالكواشف أفيدين يجمد، مثل streptavidin المغلفة الخرز. ومع ذلك، ثيول-biotinylation من البروتين المستهدف لالبيوتين-BMCC، كما وصفنا هنا، مستقرة ودائمة نسبيا، ويتطلب تنقية البروتين المستهدف من قبل الأجسام المضادة الموجهة ضد الهدف، وثبتوا على الخرز sepharose و. وقد استخدمت كل التقنيات ABE سابقا على نطاق واسع الشاشات، والكشف عن البروتينات واحدة من palmitoylation 2، 8-10، 12، وعلىIP-ABE الفحص وصفنا هنا هو الأمثل للكشف السريع عن palmitoylation من البروتينات واحد هدف العصبية.
الأغلبية الساحقة من palmitoylation الخلوية ينطوي على إضافة عكسها من بالميتات إلى مجموعة من ثيول cysteines (وهو ما يسمى S-palmitoylation، ونحن التعميم باسم 'palmitoylation في هذا البروتوكول)، ومع ذلك يتعرضون مجموعة محدودة جدا من البروتينات لpalmitoylation لا رجعة فيه في جليكاين وبقايا السيستين من خلال تشكيل السندات أميد مستقرة، ووصف N-palmitoylation 13. واحد الحد من الكيمياء ABE هو عدم قدرتها على كشف N-palmitoylation نظرا لاستقرار السندات أميد، وهكذا ينبغي تأكيد الفرز من البروتين المستهدف لرواية palmitoylation باستخدام 3H-بالميتات وضع العلامات الأيضية 1.
كما ذكر سابقا، يمكن الفحص IP-ABE تكييفها بسهولة لفحص palmitoylation في مقتطفات البروتين من مصادر متعددة، بما في ذلك ترانsfected خطوط الخلايا مغاير، والأنسجة الابتدائية، والثقافات العصبية الأولية من مناطق الدماغ متعددة. وقد استخدمت مقايسة IP-ABE لدراسة الاكتفاء palmitoylation من البروتينات السيستين إلى سيرين تحور لتحديد مكان وجود السيستين palmitoylated على طول البروتين الهدف 8، لدراسة ديناميكية دوران بالميتات على البروتينات في الخلايا العصبية مثقف متشابك في ظل ظروف القاعدية 10، والتغيرات في مستويات البروتينات palmitoylation العصبية بعد تحريض نشاط الخلايا العصبية 9. حساسية وقابلية التكيف للمقايسة IP-ABE جعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة ملامح palmitoylation من البروتينات العصبية، والأمثل للكشف عن التغيرات الدينامية في palmitoylation.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة MOP-81158.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
PMSF | Fluka | 93482 | |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche Complete Mini | 11 836 153 001 | |
NEM | Sigma | E3876 | |
HAM solution | Sigma | 46780-4 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Ensure compatibility with chosen detergent |
Protein G/A-coated sepharose beads | GE Healthcare | 17-6002-35 | |
Biotin-BMCC | Thermo Scientific | 21900 | |
Streptavidin-HRP | Thermo Scientific | 21126 | Reconstitute at 1 mg/ml in water |
Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 21059 |