T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ
Summary
我々は、腫瘍標的細胞とインキュベートした場合、T細胞の細胞傷害活性を測定するための単一セルハイスループットアッセイが記載されている。この方法では、空間的に定義された比率で、T細胞と標的細胞を閉じ込めるために、サブナノリットルウェル（〜100,000ウェル/配列）の高密度、エラストマー配列を採用しており、エフェクター – 標的抱合及びその後アポトーシスを監視するために、蛍光顕微鏡に接続されている。
Abstract
癌免疫療法は、腫瘍を標的とし、排除する免疫応答の特異性を活用することができます。遺伝的にキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように改変T細胞の養子移入に基づく養子細胞療法（ACT）は、臨床試験1-4のかなりの約束を示している。そこに車を使用して+ T細胞を、MHC非制限抗原を標的とし、宿主内でホーミングと永続最適な生存のためのT細胞を、官能化する能力を含む癌の治療のためにはいくつかの利点があり、そして最後に、CARのアポトーシスを誘導するために+宿主毒性5のイベントでのT細胞。
CARの最適な機能を線引き+臨床的利点を伴うT細胞は臨床試験の次の世代を設計するために不可欠です。多光子顕微鏡のように生きている動物のイメージングにおける最近の進歩は、免疫細胞機能の研究に革命をもたらした私nの生体6,7。これらの研究は、in vivoでのT細胞の機能についての我々の理解を進めているが、臨床試験でのT細胞ベースのACTは、T細胞の調製に利用することにより、臨床的有効性の注入後との事前注入の分子および機能的特徴をリンクする必要があるのを必要とします細胞毒性およびサイトカイン分泌、のようにT細胞の機能を監視し、インビトロアッセイ。標準的なフローサイトメトリーに基づいたアッセイは、単一細胞レベルでのT細胞の集団の全体的な機能を決定するが、これらは抱合体形成と寿命または複数のターゲット8を殺すために同じ細胞の能力を監視するには適さないことが開発されている。
ポリジメチルシロキサン（PDMS）のような生体適合性ポリマーで設計微細加工された配列は、空間的に小さなボリューム9のエフェクターや目標を閉じ込めるために特に魅力的な方法です。自動化されたタイムラプス蛍光顕微鏡との組み合わせで、カントーエフェクター – 標的相互作用のusandsはnanowell配列の撮像個々のウェルで同時に監視することができます。我々はここで広く、T細胞の細胞傷害機能を研究に適用することができ、単一細胞レベルでのT細胞媒介性細胞傷害性を監視するためのハイスループットな方法論を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々はnanowellsの配列（ 図1）でエフェクターや目標の共インキュベーションを介して有効高スループット、単一セルの細胞傷害性アッセイのためのプロトコルの概要を示している。スループットに加え、技術の主な利点は、順番に標的細胞として、自己またはプライマリ/マッチした腫瘍細胞の使用を可能にする標的細胞工学を必要とせずに所望の標的細胞に対するエフェクター?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は賞の数R01CA174385下国立衛生研究所（NIH）の国立癌研究所によってサポートされていましたこの文書に報告した。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
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