Immunoprécipitation de la chromatine efficace en utilisant des quantités limitées de biomasse

Summary

Nous décrivons une méthode robuste pour immunoprécipitation de la chromatine en utilisant des cellules T primaires. La méthode est fondée sur des approches standard, mais utilise un ensemble spécifique de conditions et de réactifs qui améliorent l'efficacité pour une quantité limitée de cellules. Surtout, une description détaillée de la phase d'analyse des données est présentée.

Abstract

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode largement utilisée pour déterminer les interactions entre différentes protéines avec de l'ADN en chromatine des cellules vivantes. Exemples spécifiques d'une séquence d'ADN de liaison facteurs de transcription, histones et leurs différents états de modification, les enzymes telles que les ARN polymérases et des facteurs auxiliaires, et des composants de réparation de l'ADN. En dépit de son omniprésence, il ya un manque de jusqu'à à ce jour-, les méthodes détaillées à la fois pour la préparation du banc de matériau et pour une analyse précise permettant des mesures quantitatives de l'interaction. En raison de ce manque d'information, et aussi parce que, comme tout immunoprécipitation, les conditions doivent être ré-optimisés pour les nouvelles séries de conditions expérimentales, le dosage de la puce est sensible à des résultats inexacts ou mal quantitative.

Notre protocole est finalement dérivé du travail séminal sur le facteur de transcription: interactions ADN ^1,2, mais intègre un certain nombre d'améliorations sensivité et la reproductibilité pour à obtenir difficiles types de cellules. Le protocole a été utilisé avec succès ^3,4, à la fois en utilisant qPCR de quantifier l'enrichissement de l'ADN, ou en utilisant une variante semi-quantitative du protocole ci-dessous.

Cette analyse quantitative du matériel amplifié par PCR est effectuée calcul, et représente un facteur limitant dans l'essai. Contrôles importants et d'autres facteurs incluent l'utilisation d'un anticorps isotype, ainsi que l'évaluation d'une zone de contrôle de l'ADN génomique, comme une région intergénique prévu de ne pas être lié par la protéine à l'étude (ou prévu de ne pas montrer les changements dans les conditions expérimentales). En outre, une courbe standard de matériel d'entrée pour chaque échantillon puce est utilisée pour calculer les niveaux absolus de l'enrichissement dans le matériau expérimental. Utilisation des courbes standard permet de tenir compte des différences entre les jeux d'amorces, peu importe avec quel soin ils sont conçus, et aussi l'efficacité différerrences sur toute la gamme de concentrations de modèle pour un ensemble d'amorces. Notre protocole est différent des autres qui sont disponibles en ^5-8 que nous couvrons largement la phase d'analyse ultérieure.

Protocol

1. Isolement de souris CD4 naïfs T spléniques Cells Sacrifiez la souris de façon humaine compatible avec Institutional Animal Care et utilisation Comité protocoles (IACUC). Disséquer la rate et le placer dans un plat de Pétri contenant 10 ml de DMEM avec 10% de FBS. Ecrasez la rate à l'aide givrés extrémités de deux lames de verre pour libérer les splénocytes. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml. Recueillir les cellules par centrifugation à 2…

Representative Results

L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) protocole présenté ici contrôles des différences, le cas échéant, de la quantité d'ADN utilisée dans la PCR par l'utilisation d'une paire d'amorces qui amplifie une région non liée de génome, servant ainsi de «contrôle de chargement". Dans l'exemple illustré à la figure 3, nous avons utilisé la région codante du gène Loi de l 'souris comme une région non liée à notre protéine d'int…

Discussion

Le protocole ci-dessus fournit une méthode robuste de quantifier avec précision l'enrichissement de l'ADN des lymphocytes primaires utilisant le morceau. Une raison majeure de robustesse dans ce protocole est l'inclusion de la diversité biologique répétitions. Le protocole ci-dessus utilise trois répétitions, l'enrichissement, pour lesquels est calculé indépendamment. Les sorties sont ensuite moyennées pour fournir un degré d'enrichissement et écarts-types calculés pour fournir une mesur…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
Formaldehyde	Sigma	F-8775	Store at RT
Phosphate Buffered Saline	Hyclone	SH30256.01	Store at 4 °C
Protease Inhibitor tablets	Roche	04693116001	Store at 4 °C
Protein G magnetic beads	Active Motif	101945	Store at 4 °C
RNase A (20 mg/ml)	EMD Millipore	556746	Store at -20 °C
Proteinase K (20 mg/ml)	Roche	03115879001	Dissolve in 50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0
Platinum Taq DNA Polymerase	Invitrogen	10966-034	Store at -20 °C
SYBR Green I	Invitrogen	S7567	Store at -20 °C
1 M Glycine			Store at RT
Cell lysis buffer (5 mM Pipes, pH 8.0; 85 mM KCl; 0.5% NP-40)			Store at 4 °C
Nuclear lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.1; 10 mM EDTA; 1% SDS)			Store at RT
ChIP dilution buffer (0.01% SDS; 1.1% Triton X-100; 1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris pH 8.1; 190 mM NaCl)			Store at 4 °C
Low salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 150 mM NaCl)			Store at 4 °C
High salt wash buffer (0.1% SDS; 1% Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris pH 8.1; 600 mM NaCl)			Store at 4 °C
LiCl wash buffer (0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1% Sodium Deoxycholate, 1 mM EDTA; 10 mM Tris pH 8.0)			Store at 4 °C
TE buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM EDTA)			Store at 4 °C
Elution buffer (1% SDS; 0.1 M NaHCO3)			Prepare fresh
5 M NaCl			Store at RT
0.5 M EDTA			Store at RT
1 M Tris-HCl, pH 6.5			Store at RT
			Table of Specific Reagents
Clay Adams Brand Nutator	Becton Dickinson	Model: 421105
Magnetic Stand	Promega	Z5342
Qiaquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Masonix Sonicator 3000	QSonica	Model: S3000
UV Spectrophotometer	NanoDrop Technologies	ND-1000
Heating Block	VWR	13259-030
Rotator	VWR	80085-692
Refrigerated bench top centrifuge	Beckman Coulter	Model: Allegra X-12R
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
			Table of Equipment