포유류의 세포에서 Endoplasmic 소포체 현지화 mRNAs의 시각화
Summary
여기 포유류의 조직 배양 세포에서 endoplasmic 소포체 – 관련 mRNAs을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 형광등에 이어 세포질 내용을 제거 할 digitonin과 플라즈마 막의 선택적 permeabilization을 포함<em> 현장에서</em어느 대량 폴리 (A) mRNA 또는 특정 기록을 검색 할 수> 하이브리드.
Abstract
eukaryotes에서 분비와 막 단백질이 소포체 endoplasmic (ER)의 표면에 지역화 아르 인코딩 메신저 RNAs (mRNAs)의 대부분. 그러나 이러한 mRNAs의 시각화가 도전 할 수 있습니다. 이것은 mRNA의 일부만이 ER-관련 될 때 특히 사실이다이 세포 기관과의 배포가 아닌 타겟 (예 : "무료") 성적 증명서에 의해 가려합니다. 동시에 ER의 무결성을 유지하면서 ER-관련 mRNAs을 모니터링하기 위해, 우리는 세포가 선택적으로 플라즈마 멤브레인을 permeabilizes digitonin 추출 솔루션에 대한 짧은 노출로 치료되는 방법을 개발하고, 따라서 세포질 내용을 제거했습니다 . 이 방법은 현장 하이브리드 화 (물고기)의 형광와 결합 될 때, 하나는 분명 형광 현미경으로 ER-바운드 mRNAs를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 대량 폴리 (A) 성적 증명서 또는 특정 mRNAs 중 하나에 ER-협회의 정도를 평가 할 수 있습니다심지어 정량. 이 과정에서, 하나는 mRNA-ER 상호 작용의 특성을 조사하기 위해이 분석을 사용할 수 있습니다.
Introduction
eukaryotes에서 mRNA 인코딩 번역 3,4 동안 리보솜과 translocons 사이의 직접 상호 작용을 통해 분비와 막 단백질은 공동 translationally 신호 인식 입자 1,2에 의해 응급실로 타겟팅 할 수 있으며, ER에서 유지 관리 할 수 있습니다. 그러나, mRNAs가 타겟팅하고 리보솜 또는 번역 중의 ER 독립을 유지 할 수 있는지 여부 것은 매우 최근까지 불분명했다. 이전 연구는 세포 분획 기법을 사용하여 ER로 번역 독립적 인 mRNA 협회가 있는지 해결하기 위해 시도했습니다. 거친 화학 조건이 잠재적으로 민감한 mRNA-ER 협회가 바뀐다 ER 파생 소포에서 리보솜을 해제해야 되었기 때문에,이 연구는 5-8에 대한 증거를 제공하고, 결정적이었고 9,10에 대한 ribosomal 독립적 인 mRNA의 응급실로 고정 .
이러한 문제를 회피하기 위해 우리는 proto을 개발했습니다콜 분리 및 이미지 ER-바운드 mRNAs를합니다. 이 절차를 동시에 ER 형태와 관련 분자의 모든을 유지하면서 효과적으로 세포 (비 ER-바운드 mRNAs 포함)의 모든 세포질 내용을 제거 가벼운 추출 치료를하는 것입니다. 이 프로토콜 사용 우리는 mRNAs의 일부 타겟팅하고 독립적으로 리보솜 또는 번역 (11)의 ER에 유지하는 증명하고있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양한 subcellular 사이트에 mRNAs의 현지화는 mRNA의 현지화 단백질과 성적의 상호 작용을 통해 subcellular의 로컬 요구 사항에 대한 그들의 최종 목적지 단백질의 적절한 정렬을위한, 그리고 유전자 표현의 미세 조정에 중요한 널리 현상입니다 지역 19,20.
검정을 사용하면 여기에 설명 된, 우리는 분비 단백질을 인코딩 mRNAs는 리보솜 또는 번역의 유무에 ER에서 유지 될 수 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 XAC와 AFP에 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에서 보조금에 의해 지원되었다
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