نحن هنا وصف طريقة لتصور الشبكة الهيولية الباطنة المرتبطة mRNAs والثدييات في خلايا الأنسجة. هذا الأسلوب الذي ينطوي على permeabilization الانتقائي للغشاء البلازما مع ديجيتونين لإزالة محتويات حشوية تليها الفلورسنت<em> في الموقع</em> التهجين لكشف الجزء الأكبر إما بولي (A) مرنا أو المحاضر محددة.
في حقيقيات النوى، أكثر من الرنا المرسال (mRNAs و) التي تكود يفرز ويتم ترجمة البروتينات الغشاء على سطح الشبكة الإندوبلازمية (ER). ومع ذلك، يمكن تصور هذه mRNAs وأن يكون تحديا. هذا صحيح خصوصا عندما فقط جزء صغير من مرنا هو ER-المرتبطة بها ويتم توزيعها على عرقلة هذا عضية من النصوص (أي "الحرة") غير المستهدفة. من أجل رصد ER المرتبطة mRNAs و، وقد وضعنا طريقة التي تعامل بها مع خلايا التعرض قصيرة إلى حل استخراج ديجيتونين أن permeabilizes انتقائي غشاء البلازما، وبالتالي يزيل محتويات حشوية، مع الحفاظ في نفس الوقت على سلامة ER . عندما يقترن هذا الأسلوب مع الفلورسنت في الموقع التهجين (FISH)، يمكن للمرء تصور واضح محدد mRNAs وER بواسطة المجهر الفلورسنت. يمكن استخدام هذا البروتوكول يتم تقييم درجة ER-جمعية إما معظم النصوص (A) أو بولي mRNAs محددةوكميا حتى. في هذه العملية، يمكن للمرء أن استخدام هذا الفحص للتحقيق في طبيعة التفاعلات مرنا-ER.
في حقيقيات النوى، ويفرز ترميز مرنا يمكن استهداف البروتينات الغشاء إلى ER شارك في translationally من الجسيمات 1،2 إشارة الاعتراف ويمكن الحفاظ على ER عن طريق التفاعل المباشر بين ريبوسوم وtranslocons خلال ترجمة 3،4. ومع ذلك، ما إذا كان يمكن توجيه mRNAs والمحافظة على ومستقلة ER إما ريبوسوم أو ترجمة غير واضح حتى وقت قريب جدا. حاولت الدراسات السابقة لمعالجة ما إذا كان هناك ارتباط ترجمة المستقلة مرنا مع ER باستخدام تقنيات تجزئة الخلوية. لأن هناك حاجة إلى ظروف قاسية الكيميائية لتنأى ريبوسوم من الحويصلات المشتقة ER، والتي قد تعطل الحساس يحتمل مرنا-ER تكوين الجمعيات، وكانت هذه الدراسات غير حاسمة، وتوفير الأدلة ل5-8 و 9،10 ضد الريباسي مستقلة رسو مرنا إلى ER .
للتحايل على هذه المشاكل وضعنا بروتوالعقيد لعزل والصورة ER محدد mRNAs و. هذا الإجراء ينطوي على معاملة استخراج خفيفة، الذي يزيل بشكل فعال كل المحتوى السيتوبلازمي للخلية (بما في ذلك mRNAs وER محدد غير) مع الحفاظ في نفس الوقت على التشكل ER وجميع من الجزيئات المرتبطة به. باستخدام هذا البروتوكول قد أثبتنا أن مجموعة فرعية من mRNAs ويتم استهداف ومن ثم الحفاظ على ER أو بشكل مستقل عن ريبوسوم ترجمة 11.
توطين التحت خلوية mRNAs وإلى مواقع مختلفة، من خلال التفاعل مع النصوص البروتينات توطين مرنا، هو ظاهرة واسعة الانتشار مهمة لفرز الصحيح من البروتينات إلى وجهتها النهائية، وبالنسبة للضبط التعبير الجيني لمتطلبات محلية من التحت خلوية المنطقة 19،20.
<p class="jove_content" style=";…The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث كندا لوكالة فرانس برس وXAC