Visualisering af endoplasmatiske reticulum lokaliserede mRNA'er i pattedyrceller
Summary
Her beskriver vi en metode til at synliggøre endoplasmatiske reticulum-associerede mRNA'er i mammale vævskulturceller. Denne teknik involverer selektiv permeabilisering af plasmamembranen med digitonin til fjernelse af cytoplasmatisk indhold efterfulgt af fluorescerende<em> In situ</em> Hybridisering til påvisning af enten bulk-poly (A) mRNA eller specifikke transkripter.
Abstract
I eukaryoter. Fleste af messenger RNA'er (mRNA'er), der koder for secernerede og membran-proteiner er lokaliseret til overfladen af det endoplasmatiske reticulum (ER) Dog kan visualiseringen af disse mRNA'er være udfordrende. Dette er især tilfældet, når kun en brøkdel af mRNA'en er ER-associeret og deres fordeling til dette organel hindres af ikke-målet (dvs. "fri") transkripter. For at overvåge ER-associerede mRNA'er, har vi udviklet en fremgangsmåde, hvor celler behandles med en kort eksponering for en digitonin ekstraktionsmiddel, der selektivt permeabilizes plasmamembranen, og således fjerner de cytoplasmatiske indhold, at man samtidig opretholder integriteten af ER . Når denne metode kombineres med fluorescerende in situ hybridisering (FISH), kan man tydeligt visualisere ER-bundne mRNA'er ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Brug af denne protokol graden af ER-forening for enten bulk-poly (A) udskrifter eller specifikke mRNA'er kan vurderesog endog kvantificeres. Ved fremgangsmåden kan man anvende dette assay til at undersøge karakteren af mRNA-ER-interaktioner.
Introduction
I eukaryoter secerneret mRNA kodende og membranproteiner kan målrettes til ER co-translationelt ved signalgenkendelse partikel 1,2 og kan opretholdes på ER via direkte interaktioner mellem ribosomer og translocons under oversættelsen 3,4. Men hvorvidt mRNA'er kan målrettes og vedligeholdes på skadestuen uafhængig af enten ribosomer eller oversættelser var uklar indtil for ganske nylig. Tidligere undersøgelser har forsøgt at løse, om der er translation-uafhængig mRNA samarbejde med ER via et trådløst fraktioneringsteknikker. Fordi barske kemiske betingelser skulle adskille ribosomer fra ER afledte vesikler, som vil kunne skabe potentielt følsomme mRNA-ER forening, disse undersøgelser var inkonklusive, der beviser for 5-8 og imod 9,10 ribosomal-uafhængig forankring af mRNA til ER .
At omgå disse problemer har vi udviklet en protocol at isolere og billedet ER-bundne mRNA'er. Denne procedure indebærer en mild ekstraktionsbehandling, der effektivt fjerner al den cytoplasmiske indhold af cellen (herunder ikke ER-bundne mRNA'er) samtidig bevare ER-morfologi og alle dertil hørende molekyler. Under anvendelse af denne protokol, har vi vist, at en delmængde af mRNA'er målrettes og derefter holdt på ER uafhængigt af ribosomer eller oversættelse 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lokaliseringen af mRNA'er til forskellige subcellulære steder, gennem interaktion af udskrifter med mRNA lokalisering proteiner, er et udbredt fænomen vigtig for en korrekt sortering af proteiner til deres endelige bestemmelsessted, og for finjustering af genekspression til de lokale krav til et subcellulært region 19,20.
Anvendelse af assayet beskrevet her, vi revisited hvorvidt mRNA'er, der koder sekretoriske proteiner kan opretholdes på ER i nærvær eller fra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science and Engineering Research Council of Canada til XAC og AFP
References
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
- Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
- Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
- Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
- Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
- Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
- Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
- Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
- Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
- Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
- Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
- Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
- Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. 생화학. 11, 3060-3064 (1972).
- Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
- Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
- Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
- Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).
