Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères
Summary
Nous décrivons ici une méthode pour visualiser réticulum endoplasmique associés ARNm dans les cellules de culture de tissus de mammifères. Cette technique implique l'perméabilisation sélective de la membrane plasmique avec de la digitonine à supprimer les contenus cytoplasmiques suivie par fluorescence<em> In situ</emHybridation> pour détecter soit en vrac poly (A) ARNm ou transcrits spécifiques.
Abstract
Chez les eucaryotes, la plupart des ARN messagers (ARNm) codant pour des protéines membranaires et sécrétées sont localisés à la surface du réticulum endoplasmique (RE). Cependant, la visualisation de ces ARNm peut être difficile. Cela est particulièrement vrai lorsque seule une fraction de l'ARNm est ER-associé et leur distribution à cet organite est obstrué par des non-ciblées (par exemple «libre») les transcriptions. Afin de surveiller ER-ARNm associés, nous avons développé une méthode dans laquelle les cellules sont traitées avec une courte exposition à une solution d'extraction digitonine que perméabilise sélective de la membrane plasmique, et supprime ainsi le contenu cytoplasmique, tout en maintenant l'intégrité de l'ER . Lorsque cette méthode est couplée avec hybridation fluorescente in situ (FISH), on peut visualiser clairement ER-ARNm liés par microscopie à fluorescence. En utilisant ce protocole le degré d'association pour ER-soit en vrac poly (A) relevés de notes ou ARNm spécifiques peuvent être évaluéset même quantifiés. Dans le processus, on peut utiliser ce test pour étudier la nature de l'ARNm-ER interactions.
Introduction
Chez les eucaryotes, l'ARNm codant pour les protéines membranaires et sécrétées peuvent être ciblés pour l'ER co-traductionnelle par le 1,2 particules signal de reconnaissance et peut être maintenue sur l'urgence par le biais des interactions directes entre les ribosomes et translocons lors de la traduction 3,4. Toutefois, si les ARNm peuvent être ciblés et maintenu sur l'examen indépendant ER soit de ribosomes ou la traduction n'était pas clair jusqu'à très récemment. Des études antérieures ont tenté de répondre s'il ya association ARNm traduction indépendante de l'ER en utilisant des techniques de fractionnement cellulaire. Parce que les conditions chimiques agressifs étaient tenus de dissocier les ribosomes de ER vésicules dérivées, ce qui pourrait potentiellement perturber le délicat ARNm-ER association, ces études n'ont pas été concluants, fournissant des preuves pour 5-8 et contre 9,10 ribosomique indépendante d'ancrage de l'ARNm de l'ER .
Pour contourner ces problèmes, nous avons développé un prototypecol d'isoler et d'image liés ER-ARNm. Cette procédure implique un traitement d'extraction doux, ce qui supprime efficacement tout le contenu cytoplasmique de la cellule (y compris non liés ARNm ER) tout en conservant la morphologie ER et l'ensemble de ses molécules associées. En utilisant ce protocole, nous avons démontré qu'un sous-ensemble des ARNm sont ciblées et ensuite maintenue sur l'urgence indépendamment des ribosomes ou de traduction 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
La localisation des ARNm vers divers sites subcellulaires, grâce à l'interaction avec les protéines de la transcription d'ARNm de localisation, est un phénomène répandu important pour le tri correct des protéines vers leur destination finale, et pour le réglage fin de l'expression génique aux exigences locales d'un subcellulaire 19,20 région.
En utilisant le test décrit ici, nous avons réexaminé la question de savoir si les ARNm qui codent pour des pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science et génie du Canada à XAC et l'AFP
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