La visualización de los ARNm retículo endoplásmico localizados en células de mamíferos
Summary
Aquí se describe un método para visualizar retículo endoplasmático asociados mRNAs en células de cultivo de tejidos de mamíferos. Esta técnica implica la permeabilización selectiva de la membrana plasmática con digitonina para eliminar el contenido citoplásmico seguido por fluorescente<em> In situ</emHibridación> a detectar sea a granel poli (A) mRNA o transcripciones específicas.
Abstract
En eucariotas, la mayoría de los ARN mensajeros (ARNm) que codifican proteínas de membrana y secretada están localizados en la superficie del retículo endoplásmico (ER). Sin embargo, la visualización de estos mRNAs puede ser un reto. Esto es especialmente cierto cuando sólo una fracción del ARNm es ER-asociado y su distribución a este orgánulo es obstruida por no objetivo (es decir, "libre") transcripciones. A fin de supervisar ER-asociados mRNAs, hemos desarrollado un método en el que las células se tratan con una corta exposición a una solución de extracción que digitonina selectivamente permeabiliza la membrana plasmática, y por lo tanto elimina los contenidos citoplásmicos, manteniendo al mismo tiempo la integridad de la ER . Cuando este método se acopla con hibridación in situ fluorescente (FISH), uno puede visualizar claramente ER-mRNAs unidos por microscopía fluorescente. Usando este protocolo el grado de ER-asociación, ya sea para granel de poli (A) o transcripciones de ARNm específicos puede evaluarsee incluso cuantificados. En el proceso, se puede utilizar este ensayo para investigar la naturaleza de las interacciones ER-mRNA.
Introduction
En eucariotas, el ARNm que codifica secretadas y proteínas de membrana pueden ser dirigidos a la ER co-traduccional por la partícula de reconocimiento de señal de 1,2 y se puede mantener en el ER a través de las interacciones directas entre los ribosomas y translocons durante la traducción 3,4. Sin embargo, si mRNAs pueden ser dirigidos y mantenidos en la sala de emergencia independiente de cualquiera de los ribosomas o la traducción no está claro hasta muy recientemente. Estudios previos tratado de abordar la existencia de traducción independiente de la asociación con el mRNA ER utilizando técnicas de fraccionamiento celular. Debido a las duras condiciones químicas se requiere para disociar los ribosomas de ER vesículas derivadas, que pueden bloquear la potencialmente delicada ARNm-ER asociación, estos estudios no fueron concluyentes, proporcionando evidencia de 5-8 y 9,10 contra ribosomal independiente de anclaje de ARNm al ER .
Para superar estos problemas, se ha desarrollado un protopara aislar y col imagen ER-enlazados mRNAs. Este procedimiento consiste en un tratamiento de extracción suave, que elimina eficazmente todo el contenido citoplasmático de la célula (incluyendo los no consolidados ER-mRNAs) y al mismo tiempo preservar la morfología de ER y de todas sus moléculas asociadas. Usando este protocolo, hemos demostrado que un subconjunto de mRNAs están dirigidos y después se mantuvo en el ER independientemente de los ribosomas o la traducción 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
La localización de los ARNm a varios sitios subcelulares, a través de la interacción con las proteínas de las transcripciones de ARNm de localización, es un fenómeno generalizado importante para la selección adecuada de las proteínas a su destino final, y para el ajuste fino de la expresión de genes a los requisitos locales de una subcelular 19,20 región.
Usando el ensayo descrito aquí, se volvió a examinar la cuestión de si los ARNm que codifican proteínas de secrec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de la National Science and Engineering Research Council de Canadá a XAC y AFP
References
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
- Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
- Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
- Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
- Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
- Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
- Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
- Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
- Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
- Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
- Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
- Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
- Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. 생화학. 11, 3060-3064 (1972).
- Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
- Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
- Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
- Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).
