Visualisering av endoplasmatiska nätverket Lokaliserade mRNA i däggdjursceller
Summary
Här beskriver vi en metod för att visualisera endoplasmatiska retiklet-associerade mRNA i däggdjursceller vävnadsodlingsceller. Denna teknik inbegriper selektiv permeabilisering av plasmamembranet med digitonin att avlägsna cytoplasmiska innehåll följt av fluorescerande<em> In situ</em> Hybridisering att detektera antingen bulk-poly (A)-mRNA eller specifika transkript.
Abstract
I eukaryoter, de flesta av budbärar-RNA (mRNA) som kodar utsöndrade och membranproteiner är lokaliserade på ytan av det endoplasmatiska retiklet (ER). Däremot kan visualisering av dessa mRNA vara en utmaning. Detta är särskilt sant när endast en bråkdel av mRNA är ER-associerad och deras fördelning till denna organell hindras av icke-riktade (dvs. "fri") transkript. För att övervaka ER-associerade mRNA, har vi utvecklat en metod i vilken cellerna behandlas med en kort exponering för en digitonin extraktionslösning som selektivt permeabilizes plasmamembranet, och därigenom avlägsnar cytoplasmiska innehåll, samtidigt som man behåller integriteten hos ER . När denna metod kopplas med fluorescent in situ hybridisering (FISH), kan man visualisera klart ER-bundna mRNA genom fluorescerande mikroskopi. Använda detta protokoll graden av ER-förening för antingen bulk poly (A)-transkript eller särskilda mRNA kan bedömasoch även kvantifieras. I processen, kan man använda denna analys för att undersöka karaktären av mRNA-ER-interaktioner.
Introduction
I eukaryoter, mRNA som kodar utsöndrade och membranproteiner kan riktas till ER sam-translationellt av signalen erkännande partikel 1,2 och kan bibehållas på ER via direkta interaktioner mellan ribosomer och translocons under översättningen 3,4. Men om mRNA kan riktas och underhållas på ER oberoende av antingen ribosomer eller översättning var oklart tills helt nyligen. Tidigare studier försökt åtgärda om det finns translation oberoende mRNA samarbete med ER hjälp av cellulära fraktioneringstekniker. Eftersom starka kemiska förhållanden var tvungna att ta avstånd ribosomer från ER härledda vesikler, som kan störa potentiellt känsliga mRNA-ER förening var dessa studier ofullständiga och ger bevis för 5-8 och mot 9,10 ribosomal-oberoende förankring av mRNA till ER .
För att kringgå dessa problem har vi utvecklat en protocol att isolera och bild ER-bundna mRNA. Detta förfarande innebär en mild extraktion behandling, som effektivt avlägsnar allt cytoplasmatiska innehållet i cellen (inklusive icke ER-bundna mRNA) samtidigt bevarar ER morfologi och alla dess associerade molekyler. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att en delmängd av mRNA är riktade och upprätthålls på ER oberoende av ribosomer eller översättning 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lokaliseringen av mRNA till olika subcellulära ställen, genom samverkan mellan transkript med proteiner mRNA lokalisering, är ett utbrett fenomen viktigt för korrekt sortering av proteiner till slutdestinationen och för finjustering av genuttryck till de lokala kraven på en subcellulär regionen 19,20.
Med användning av analysen beskriven här, revisited vi frågan huruvida mRNA som kodar för sekretoriska proteiner kan bibehållas på ER i närvaro eller frånvaro av ribos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Science and Engineering Research Council of Canada till XAC och AFP
References
- Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).
- Walter, P., Blobel, G. Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).
- Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation. Cell. 71, 489-503 (1992).
- Grlich, D., Rapoport, T. A. Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane. Cell. 75, 615-630 (1993).
- Milcarek, C., Penman, S. Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes. J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).
- Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts. J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).
- Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver. J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).
- Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation. J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).
- Kruppa, J., Sabatini, D. D. Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes. J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).
- Adesnik, M., Maschio, F. Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes. Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).
- Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum. PLoS Biol. 10, e1001336 (2012).
- Pestka, S. Inhibitors of ribosome functions. Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).
- Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine. Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).
- Weeks, D. P., Baxter, R. Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide. 생화학. 11, 3060-3064 (1972).
- Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes. Cell. 147, 789-802 (2011).
- Lerner, R. S., et al. Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA. 9, 1123-1137 (2003).
- Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors. J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).
- Lcuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).
- Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection. J Vis Exp. 46, e2387 (2010).
