グライディングアッセイを用いて生体高分子の曲げ剛性の測定
Summary
持続長や生体高分子の曲げ剛性を測定するための方法が記載されている。この方法は、実験的に個々の微小管の持続長を決定するキネシン駆動型微小管滑走アッセイを使用しており、アクチンベース滑空アッセイに適応可能です。
Abstract
微小管は細胞分裂、細胞力学、および細胞内輸送の役割を果たす細胞骨格のポリマーである。これらの各関数は、硬いとセル径のかなりの部分にまたがるようにまっすぐに十分である微小管を必要とします。その結果、微小管の持続長、剛性の尺度は、積極的に過去二十年の1のために研究されました。それにもかかわらず、オープンな疑問が残る：短い微小管が長い微小管2月4日より10〜50倍未満で硬直している、とさえ長い微小管はマグニチュード5-9の順序によって異なり永続の長さを測定した。
ここでは、微小管の持続性の長さを測定する方法を提案する。方法はキネシン駆動型微小管滑走アッセイ10に基づいています。微小管に接続されている個々の蛍光体の単粒子追跡による個々の微小管のまばらな蛍光標識を組み合わせることにより、glidin単一微小管のG軌道はナノメートルレベルの精度で追跡されます。軌道の持続長は11を使用した条件下で微小管の持続長と同じです。自動追跡ルーチンは、個々の微小管に取り付けられた蛍光団から微小管の軌跡を作成するために使用され、この軌道の持続長はIDLで書かれたルーチンを使用して計算されます。
この技術は急速に実現可能、と実験の一日で100微小管の持続長を測定することが可能である。方法は微小管に沿って長さの関数としての持続長を含め、さまざまな条件の下で持続長を測定するために拡張することができます。さらに、使用される解析ルーチンは、同様にアクチンフィラメントの持続長を測定するために、ミオシンベース演技滑走アッセイに拡張することができます。
Introduction
細胞骨格は、ほとんどの真核生物の細胞に見出される生体高分子のネットワークは、細胞組織、細胞内輸送、細胞力学の役割を果たしている。細胞骨格（主にアクチンと微小管）の生体高分子の機械的特性は、全体の12として、セルの機械的特性を決定する上で重要な役割を果たしている。細胞全体のメカニックが13,14の健康と病気の細胞を特徴付けることができると細胞運動性15に関与しているので、基礎となる細胞骨格成分の機械的特性は、過去二十年の1のための研究の活発な領域となっている。
生体高分子の柔軟性（または剛性）の周囲温度における熱揺らぎの下で約1ラジアンによる持続長、曲がるポリマーの長さによって特徴付けられる。多くの技術がexampための持続長16を測定するために開発されてきた流体力学的流れ、光トラップ、または電界4,17,18、および溶液中の遊離ポリマー5,6の変動を測定する受動的手法を用いてポリマーを曲げ伴うルアクティブ技術。アクティブな測定値は、しかし、専門的なセットアップは、マイクロメートルスケールで知られている力を実装するために必要とし、自由変動の測定は、使用される顕微鏡の焦点面の拡散切れによる挑戦することができます。
この記事では、我々は、微小管、細胞骨格ポリマーの持続長を測定するための補完的な、受動的な、テクニックを説明します。技術は、ポリマーが常に焦点面19に残っていることを確認し滑空アッセイを伴う。また、ポリマーに沿った特定の場所が十分に特徴付けられるように、興味のあるポリマーに永久的に取り付け追跡単一フルオロフォアを伴う。
メソッドの漫画はFigurに示されているE 1。キネシンは微小管の+端に向けて具体的に移動するので、滑空アッセイにおける微小管は一方向に推進される。微小管の先端は、接続された最後のキネシンを越え、周囲の溶液の熱力の下で変動して自由である。微小管を前方に推進されるように、終わりはスライドガラスに沿ってさらに新しいキネシン分子に結合するまで、与えられた変動でフリーズ変動します。キネシンは非常に強く、微小管を添付しているため、微小管は先端の道を歩むように制約されます。したがって、微小管軌道に凍結統計的変動は微小管11の自由端の統計的変動と同じであるので、20によると持続長を計算するために使用することができます
<img alt="式（1）" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg" />
L Pは微小管の持続長であり、θsは輪郭長で区切ら軌道への接線間の角度であり、<>輪郭長で区切ら位置のすべてのペアの平均を表している。
滑空アッセイ自体は、特にストレプトアビジン-ビオチン結合を介してスライドガラスに結合したコイルドコイル21でキネシンビオチン化が使用されます。このアタッチメントは、モータードメインはに結合し、微小管を推進して自由であることを保証します。微小管の軌跡をたどるためには、微小管はまばらに有機フルオロフォアで標識されている22,23 -ラベルは単一フルオロフォアが単一分子蛍光顕微鏡を用いて解決可能であることを十分に疎である必要があります。単一フルオロフォアはIDLで書かれた画像解析ルーチンを使用して追跡されます。各蛍光体の軌道が与えられたマイクにバインドrotubuleは自動的に24複合微小管軌道に結合されます。軌道に沿った各点からθ接線の角度が計算され、これらの接線の角度から<cosθをs>の値は、各輪郭長 sのために計算される。最後に、これらのデータは、式に合わされます。 1与えられた微小管のために持続長を抽出するために、または同じ滑走アッセイにおける多くの微小管のため。
この方法は、さまざまな条件（異なる安定化剤または微小管に結合した他の小分子と、結合した微小管関連タンパク質（MAP）を使って、または粘性溶液の様々）で作製した微小管で動作するように十分に堅牢です。私たちの研究室では、この技術は、異なる安定剤と微小管と微小管に沿って長さの関数として、微小管の持続長を特徴付けるために使用されています。主な制限は、微小管がまだの必要があるということですupportコマンドキネシンの運動。キネシンは、堅牢なモーター酵素であるので、これはかなり緩い制限です。ミオシンファミリーの酵素を用いてアクチンとキネシンと微小管を交換することによって、アクチンの持続長は、同じ手法を用いて測定することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
持続長の測定は、個々の生体高分子の機械的特性の優れた特性があります。この記事では、我々は、微小管の持続長を測定する方法を説明してきました。ように、ステップ1.1、3.9、、この方法は容易に単に滑空アッセイの最終工程で試薬、温度、粘度を変えることにより様々な条件で微小管の機械的性質を調べることに拡張される導入部で述べたように、または重合微小管によって、さまざ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、プロトコルを実証するために、図1とアンナRatliffを準備支援のためメリッサ作者：klockeに感謝します。この作品は、科学振興のための研究·コーポレーションがサポートされていました。
Materials
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
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