מדידות קשיחות כפיפה של Biopolymers שימוש במבחני דאייה
Summary
שיטה למדידת אורך ההתמדה או קשיחות כפיפה של biopolymers מתוארת. השיטה משתמשת assay גלישת microtubule kinesin מונע בניסוי כדי לקבוע את אורך ההתמדה של microtubules הבודד וניתנת להתאמה למבחני גלישה יקטין מבוססים.
Abstract
Microtubules הם פולימרי cytoskeletal אשר ממלאים תפקיד בחלוקת תאים, מכניקה של תאים, ותחבורה תאית. כל אחת מהפונקציות הללו דורש microtubules שנוקשים וישר מספיק כדי להקיף חלק משמעותי של קוטר התא. כתוצאה מכך, אורך microtubule התמדה, מידה של נוקשות, נחקר באופן פעיל בשני העשורים האחרונים 1. עם זאת, נותרו שאלות פתוחות: microtubules הקצר הם 10-50 פעמים פחות נוקשה מאשר microtubules הארוך 2-4, ואפילו microtubules הארוך מדד אורכי התמדה המשתנים על פי סדר הגודל 5-9.
כאן, אנו מציגים שיטה למדידת אורך התמדת microtubule. השיטה מבוססת על בדיקת גלישת microtubule kinesin מונחה 10. על ידי שילוב של ניאון תיוג דליל של microtubules הבודד עם מעקב אחת של חלקיק הבודד fluorophores המצורף לmicrotubule, glidinמסלולי G של microtubules הבודד מתבצעים מעקב בדייקנות ננומטר ברמה. אורך ההתמדה של המסלולים הוא זהה לאורך ההתמדה של microtubule בתנאים המשמשים 11. שגרת מעקב אוטומטית משמשת ליצירת מסלולי microtubule מfluorophores המצורף לmicrotubules הבודד, ואורך ההתמדה של מסלול זה מחושב באמצעות רוטינות שנכתבו בIDL.
טכניקה זו היא מהירות ישימה, ומסוגל למדוד את אורך ההתמדה של 100 microtubules ביום אחד מניסויים. השיטה ניתן להאריך למדידת אורך התמדה תחת מגוון רחב של תנאים, כולל אורך התמדה כפונקציה של אורך יחד microtubules. יתר על כן, את שגרת הניתוח משמשת יכולה להיות מורחבת למבחני שרירן מבוסס משחק גלישה, כדי למדוד את אורך ההתמדה של סיבי יקטין גם כן.
Introduction
Cytoskeleton, רשת של biopolymers נמצא ברוב התאים האיקריוטים, ממלא תפקיד בארגון סלולרי, תחבורה תאית, ומכניקת תא. המאפיינים המכאניים של biopolymers של cytoskeleton (בעיקר תקטין וmicrotubules) לשחק תפקיד משמעותי בקביעת התכונות המכאניות של התא ככולו 12. מאז שלמה מכניקה סלולרית יכולה לאפיין תאים בריאים וחולים 13,14 ומעורב בתנועתיות סלולריות 15, את התכונות המכאניות של רכיבי cytoskeletal הבסיסיים היו אזור פעיל של מחקר בשני העשורים האחרונים 1.
הגמישות (או נוקשות) של biopolymers מאופיין באורך ההתמדה, אורכו של פולימר אשר מתכופף על ידי כ 1 רדיאן תחת תנודות תרמיות בטמפרטורת הסביבה. מספר הטכניקות פותח כדי למדוד אורך התמדה 16, לexampטכניקות פעילות le אשר כרוכות כיפוף הפולימר באמצעות זרימה הידרודינמית, מלכודות אופטיות, או שדות חשמליים 4,17,18, וטכניקות פסיביות אשר מודדות את התנודות של פולימרים חופשיים בפתרון 5,6. המדידות הפעילות, עם זאת, דורשות setups המיוחד כדי ליישם את הכוחות ידועים בסולם מיקרומטר, והמדידות, התנודות חופשיות יכולות להיות מאתגרות בשל דיפוזיה מחוץ למטוס של מוקד מיקרוסקופ בשימוש.
במאמר זה, אנו מתארים, טכניקה משלימה, פסיבית כדי למדוד את אורך ההתמדה של microtubules, פולימר cytoskeletal. הטכניקה כוללת מבחני דאייה, אשר להבטיח כי הפולימר נשאר תמיד במישור המוקד של 19. יתר על כן, זה כרוך fluorophores מעקב הבודד מחובר באופן קבוע לפולימר של ריבית, כך שמקומות מסוימים לאורך הפולימר מאופיינים היטב.
קריקטורה של השיטה מוצגת בFigurדואר 1. Kinesin נע במיוחד לקראת הסוף + של microtubules, כך microtubules בassay גלישה הם מונעים unidirectionally. הסוף המוביל של microtubule, מעבר kinesin האחרון צורף, הוא חופשי להשתנות תחת כוחות התרמיות של הפתרון שמסביב. כmicrotubule מונע קדימה, הסוף משתנה עד קשירת מולקולה חדשה kinesin המשך שקופית הזכוכית קופא בתנודות נתונות. בגלל kinesin מייחס microtubules חזק מאוד, microtubule מוגבל ללכת בדרך של הסוף המוביל. לכן, התנודות הסטטיסטיות שקפאו למסלול microtubule זהות לתנודות הסטטיסטיות של הקצה החופשי של 11 microtubules, ולכן יכולות לשמש כדי לחשב את אורך ההתמדה פי 20
<img alt="משוואה 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" srג = "/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg" />
איפה אני p הוא אורך ההתמדה של microtubule, θ s היא הזווית בין משיקים למסלול המופרד באורך של קו מתאר, ו<> מסמן ממוצע לאורך כל הזוגות של עמדות המופרדות באורך של קווי מתאר.
Assay הגלישה עוצמה משתמש biotinylated kinesin ב21-הסליל מפותל קשורים באופן ספציפי לשקופית הזכוכית באמצעות הצמדת streptavidin-ביוטין. התקשרות זו מבטיחה כי התחומים המוטוריים חופשיים להיקשר ולהניע microtubules. על מנת לעקוב אחר מסלולי microtubule, microtubules מתויגים דלילות עם fluorophores אורגני 22,23 – התוויות חייבות להיות דלילות מספיק שfluorophores היחיד הם פתיר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מולקולה בודדה. fluorophores היחיד נמצאים במעקב באמצעות שגרת ניתוח תמונה נכתבה בIDL. המסלולים שכל fluorophore חייבים מיקרופון ניתןrotubule משולבים לתוך מסלול microtubule מורכב באופן אוטומטי 24. זוויות θ לכל נקודה לאורך מסלול המשיקות מחושבות; מזוויות משיקות אלה <cosθ של> הערך מחושב לכל אורכו של קו מתאר. לבסוף, נתונים אלה מתאימים למשוואה. 1 כדי לחלץ אורך התמדה לmicrotubule נתון, או לmicrotubules רב באותו assay הדאייה.
השיטה היא חזקה מספיק כדי לעבוד עם microtubules הוכן במגוון רחב של מצבים (עם סוכנים שונים מייצבים או מולקולות קטנות אחרות מאוגדים לmicrotubule, עם חלבונים מאוגדים microtubule קשור (מפות), או עם מגוון רחב של פתרונות צמיגים). במעבדה שלנו, הטכניקה נעשתה שימוש כדי לאפיין את אורך ההתמדה של microtubules כפונקציה של אורך לאורך microtubules וmicrotubules עם סוכני מייצבים שונים. המגבלה העיקרית היא שmicrotubules חייב עדיין שלתנועתיות upport kinesin. מאז kinesin הוא אנזים מנוע חזק, זוהי מגבלה די רופפת. על ידי החלפת microtubules עם אקטין וkinesin עם משפחת אנזים מיוזין, אורך ההתמדה של אקטין יכול להימדד באותה הטכניקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מדידות אורך התמדה הן אפיון טוב של התכונות המכאניות של biopolymers הבודד. במאמר זה, יש לנו תאר שיטה למדידת אורך ההתמדה של microtubules. כפי שצוין במבוא, שיטה זו היא להרחיב בקלות לבחינת מאפייני microtubule מכאניים במגוון רחב של תנאים פשוט על ידי שינוי את ריאגנטים, הטמפרטורה, או הצמיגות ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למליסה Klocke לסיוע הכנת האיור 1 ואנה רטליף להוכחה בפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי חברת המחקר לקידום מדע.
Materials
| Reagents | |||
| imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| BSA | Calbiochem | 126615 | |
| biotinylated BSA | Thermo Scientific | 29130 | |
| α-casein | Sigma-Aldrich | C6780 | |
| streptavidin | Thermo Scientific | 21125 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| paclitaxel | LC Laboratories | P-9600 | |
| glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| catalase | Sigma-Aldrich | C100 | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Toxic. Buy small amount. |
| 24X60 mm No. 1 1/2 cover glass | VWR | 48393-252 | |
| 22X22 mm No. 1 cover glass | Gold Seal | 3306 | |
| High Vacuum Grease | Dow-Corning | NA | |
| Equipment | |||
| TIRF microscope | many | NA | The TIRF microscope used in this method was home-made. |
| IDL (software) | Exelis | NA | Could substitute MATLAB, ImageJ, or other image analysis software. |
References
- Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
- Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
- Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102 (2008).
- Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
- Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
- Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
- Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
- Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
- van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
- Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
- Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. “Gliding assays” for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
- Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627 (2011).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
- Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
- Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
- Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
- Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
- van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
- Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. . Physical biology of the cell. , (2008).
- Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
- Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
- Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
- Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
- Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
- Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
- Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).
