Burada optik temizleyerek, ve kemirgen beyin dokusunda kronik implante Mikrocihazlarda çevresindeki görüntüleme sağlam beyin dokusuna arayüzü, etiketleme, yakalamak için bir histolojik yöntem sunuyoruz. Bu yöntem oluşan tekniklerden elde edilen sonuçlar, çevreleyen doku ile ilgili çeşitli nüfuz edici beyin-implant etkisini anlamak için yararlıdır.
Tasarım ve bu mikroelektrot dizileri gibi beyne yerleştirilmiş Mikrocihazlarda, kullanımı üzerine araştırmalar, beyin dokusu çevresindeki kronik arayüz klinik cihazlar üretmeyi hedeflemektedir. Bu implantlar çevreleyen doku cihazlar etrafında bir yalıtım "glial yara izi" oluşumunu içeren saat boyunca cihazların varlığına tepki olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, bu doku değişikliklerin histolojik analiz tipik olarak ilgili doku morfolojisi bozabilir bir süreç içinde, aygıt eksplante sonra gerçekleştirilir.
Burada kortikal implante cihazlar kemirgen beyin dokusu çevresindeki bozulmamış toplandığı bir protokol göstermektedir. Bir kez sabitleştirici ile perfüze nasıl tarif beyinleri çıkartılmış ve eksplante cihazlar önlemek için olduğu gibi bu tür bir şekilde dilimlenmiş. Biz floresan antikor etiketleme ve bilgilendirici, ama kalın bir doku üretmek için kullanışlı optik temizleme yöntemleri ana hatlarıylabölüm. Son olarak, beyne yerleştirilmiş aygıtların çevresindeki biyolojik arayüzü araştırmak amacıyla bu doku bölümlerinin montaj ve görüntüleme göstermektedir.
Neuroprosthetic araştırma alanında cihazlar 1,2 arabirim MSS yoluyla vücudun hastalıklı yada hasarlı yapıların atlayarak çeşitli engelli ve rahatsızlıkları olan kişilerde yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Böyle mikroelektrot diziler (ÇÇA'lar) gibi beyin-implante Mikrocihazlarda, kaydedebilir veya teşvik beyin yapıları, ve böylece elektronik ve MSS dokusu 3-5 arasında uzun dönemli arabirimler kurulmasına izin vermek için kullanılabilir. Penetran ÇÇA'lar, beyin dokusu içine sürülür cihazları, onlar yakın nöronlar 6 nispeten küçük bir dizi elektrot sunmak, içinde yakınlığı nedeniyle çift yönlü arayüzleri olarak özellikle sözü tutun.
Ancak, penetran ÇÇA'lar ve uzun vadeli implantasyonu kompleks yumuşak doku tepkileri sonucu, genellikle ay gün boyunca değişken ve giderek aşağılayıcı elektrofizyolojik sinyal-gürültü oranları ile sonuçlanan ve elektrik imped bir artışElektrot bölgelerinde ve toprak 7,8 arasındaki ance. Bu değişikliklerin olası kökenleri mikroglia aktivasyonu, Mikrocihazlarda boyunca reaktif astrositoz ve implante cihazlar 9-11 çevreleyen dokudan nöronların kaybı veya göç almaktadır. Kronik, penetrasyon ÇÇA'lar etrafında bu doku değişiklikleri anlamak için büyük bir meydan okuma kronik implante cihazlarda 12 çevredeki sağlam doku arayüzünün histolojik verileri yakalayan zorluk. Hala mevcut cihaz / doku arayüzü ile doku histolojik analizi Geçerli aygıt kaldırma histolojik protokolleri geliştirmek istiyorum. Doku içinde kalan deliksiz bir cihaz ile, bu gibi biyo uyumlu kaplama 13,14 ya da 15,16 elektrot yüzey arasında elektrik açıklığın kullanımı gibi nispeten ince etkileşim, biyolojik etki yansıması olabilir ve implant ile ilgili olarak incelenmiştir.
Here biz toplamak için yöntem, süreç ve görüntü çevreleyen beyin dokusunun ayrıntılı mikroskopi tabanlı analiz için sağlam microdevice arabirimi göstermelidir. Bu yöntem, aygıt ve beyin dokusu çevresindeki bir vibratome kullanılarak kalın (> 250 um) doku bölümü içinde toplanır. Bu kalın dilimler halinde histolojik etiketi penetrasyonunu artırmak için, floresan histokimyasal ve immünohistokimyasal etiket birden fazla gün için engelleme serum ve deterjan içeren solüsyonlar yüksek konsantrasyonlarda uygulanır. Bir optik temizleme solüsyonu mikroskobu görüntüleme derinliklerinde iyileştirmek için kullanılır ve doku konfokal mikroskopi 17 tarama sonraki lazer için 2 taraflı odalarına monte edilir. Tam histolojik arayüzü yakalamak için, bilgisayar kontrollü translasyon aşamasında implantların uzunluğu boyunca z yığın panoramalar toplamak için görüntüleme sırasında kullanılır. Görüntüleme yanı sıra implantlar geri lazer yansıma toplanması, doku etiketleri uygulananve doku yardımı ile her ikisi de transmisyon ışığı çevreleyen doku ile ilgili olarak, cihaz arabirimi yerleşir. Doku Bu "Aygıt Yakalama Histoloji" kullanılarak hazırlanmıştır (DCHist) protokolü morfolojik korunmuş doku / cihaz etkileşimler görüntüleme erişim sağlar ve böylece önceki aygıtın kaldırılması histolojik protokolleri 18 geliştirir.
Burada gösterilen "Cihaz Yakalama Histoloji" (DCHist) yöntemi, beyin dokusu ve doku implantları arasındaki morfolojik korunmuş etkileşimlerin yakın histolojik değerlendirmesine olanak tanır. DCHist doku toplama beyin implante bileşenleri kafatası monte edilmiş bir aygıt bileşenlerinin dikkatli bir şekilde ayrılması gerekir. DCHist de, kalın bir histolojik doku dilim (> 250 um) toplanması gerekmektedir. Bu doku kesitlerinde, bir kez, etiketli temizlenmiş, monte, ve görüntülü, implantasyon yaralanma veya kalıcı cihazlar izleyen kronik tepkisi konusuna yeni bakış açıları sağlayabilir. Şekil 3-5 de gösterildiği gibi ileri mikroskopi araçları kullanarak, doku ve cihaz arasındaki arayüz imaged olabilir ve yüksek detaylı olarak incelenmiştir.
Mevcut formunda sunulan teknikler yavaş yavaş aşağı cihazın implantasyonu noktasına iki parçalı diş çimento ve Kwik-Sil yapılan headcap uzakta kazmaya yeteneğine güveniyor.Uzaklıkta yanmış veya başka çıkarılabilir diş çimento ve küçük makas görsel ölçüde başarıyla kafatası monte bileşenleri implante cihaz ayıran yardımcı rehberlik hangi aracılığıyla açık bir silikon elastomer kullanılması. In situ onu toplamak için kafatası altı ve beyin yukarıda cihaz kesmek çalışmak kafatası monte edilmiş bir implant beyin, önemli miktarda çıkardı edileceği gibi, tavsiye edilmez.
Böyle NeuroNexus Technologies tek saplı ÇÇA'lar gibi ince, daha küçük implantlar, DCHist en müsait olmasına rağmen, ilkeleri tek bir cihaz Shanks veya mikroelektrot diziler ile sınırlı değildir. Toplama ve görüntüleme stratejilerini gereksinimleri herhangi bir kafatası montaj ayrılmış ve kalın bir doku bölüm içinde toplanması gerektiğini olmanın, multi-şaft cihazları ve kanüller gibi büyük implantlar geniş uygulanabilir. Yazarlar doku analizi üzerinde duruldu rağmenÇevre kortikal implantlar, beynin derinliklerine tahrik cihazları da toplanan ve yansıması olabilir. Implant yerleştirme ve derinlik cihaz ekleme bilinen açıdan vahşice sapma şartıyla bir dilim içinde implant yakalama etkilememelidir.
Sınırlamalar DCHist yöntemin yararlı bir uygulama için mevcuttur. Optik temizleme çözümleri büyük ölçüde çeşitli dokularda 21 görüntüleme derinlikleri artırabilir ancak Beyin doku kesitlerinde, özellikle beyaz cevher alanlarında, mikrometre yüzlerce görüntü meydan okuyorlar. İlave görüntüleme derinlik arttırmak için, iki-foton uyarılması tarif edilen optik mikroskopi temizleme ile birlikte kullanılabilir.
Tarif edilen yöntemin bir başka potansiyel sınırlama araştırmacılar tarafından kullanılan özel floresan immünohistokimya yöntemler ve antikorları olabilir. Pasif difüzyon genellikle sabit dokusu ile bu belirteçlerin eklenmesi sürücülerve antijen bağlama siteleri üzerine. Final antikor çalışma konsantrasyonları arka etiketleme yüksek düzeylerde kaçınarak etiketi penetrasyonu maksimize vaka bazında bir durumda ilgili araştırmacılar tarafından tespit edilmelidir. Antikor etiketleme aynı işlenir dilimleri arasında değişken olmamalıdır, ancak farklı antikorları bazı antikorlar kolayca antijenleri mikrometre sadece onlarca derin antijenleri etiketlenmesi birçok derin yüz mikrometre ve diğer etiketleme ile antijen nüfuz ve etiketlemek için yeteneklerini önemli ölçüde değişebilir. Biz uygulama birden fazla gün için, tipik konsantrasyonları daha yüksek de antikor etiketler ekleyerek bu difüzyon iyileştirilmesi ve seyreltik deterjan içeren ve serum engelleyen bir çözüm. Tanımlayınız Periyodik dilimleri saygısız dahi etiketleme destekler. Antijen alma adımları ve alternatif fiksasyon süreçler (örneğin glutaraldehid, mikrodalga, vb) belirli antijenleri için uygun olabilir. İkincil antikor-fluorochBu Invitrogen Alexa Fluor etiketleri kullanarak yazarlar tarafından gözlenmemiştir olsa rome konjugatları da kalın kesitler etiketleme performans değişebilir. Alternatif olarak, ilgi hücre tiplerinde floresan protein eksprese eden transgenik hayvan deneklerin, antikor etiket penetrasyon ile ilgili sorunları önlemek için kullanılan olabilir örneğin eGFP gibi birçok floresan protein olarak, formaldehit ile tedavi sonrası floresan korumak ve doku kesitlerinde hemen görüntülenebilir.
DCHist beyin dokusu üzerine implante Mikrocihazların etkisini yakalamak ve analiz etmek için teknikler güçlü bir kümesidir. Elektrofizyoloji kalitesi ve elektrot empedans verileri 22 in vivo değerlendirilmesi ile bu histolojik protokol Coupling ölçüde fizyolojisi değişkenliği ve bozunma biyolojik kaynaklarının anlayışımızı artırabilir. Özellikle implant sinir protez cihazları alanında detaylı DCHist ima yararlanabilirbiyolojik nötr MEA cihazların geliştirilmesi bilgilendirmek için sağlam cihaz / doku arayüzünün ging.
The authors have nothing to disclose.
Tüm deneyler Purdue Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu ve Purdue Üniversitesi Laboratuar Hayvan Programı gözetiminde yapıldı.
Bu çalışma sayesinde, Güvenilir Sinir Teknolojisi Programı kapsamında Dr Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) himayesinde Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (DARPA) Microsystems Teknoloji Ofisi (MTO) tarafından sponsor oldu Uzay ve Deniz Harp Sistemleri Komutanlığı (SPAWAR) Sistemleri Merkezi (SSC) Pasifik Hibe No N66001-11-1-4013.
Yazarlar mikroskopi uzmanlık paylaşımı için Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, ve Kevin Eliceiri teşekkür etmek istiyorum.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |