Summary

Электропорации Hindbrain Трейс аксонов траектории и Synaptic Цели у эмбрионов кур

Published: May 29, 2013
doi:

Summary

Как нейронных сетей устанавливаются в эмбриональном мозге является фундаментальным вопросом в развитии нейробиологии. Здесь мы объединили метод электропорации с новых генетических инструментов, таких как Cre / LOX-плазмиды и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в заднем мозге птичьего маркировать интернейронов спинного и отслеживать их аксональное прогнозы и синаптических целей на различных стадиях развития.

Abstract

Электропорации цыпленок эмбриональной нервной трубки имеет много преимуществ, таких как быстрое и эффективное для экспрессии чужеродных генов в нервных клетках. В этой рукописи мы предлагаем способ, который демонстрирует, как однозначно электропорации ДНК в мозге на птичьем E2.75 для того, чтобы специально маркировать подмножество нейронных предшественников, и как следовать их аксональное прогнозы и синаптической цели на много продвинутых стадиях разработки, до E14.5. Мы использовали новые генетические инструменты, включая конкретные элементы усилителя, Cre / Жидкий кислород – на основе плазмид и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в целях обеспечения GFP выражение в подтип заднего мозга клеток (спинной наиболее подгруппе интернейронов, dA1). Траектории аксонов и задач dA1 аксоны следуют на ранних и поздних стадиях эмбриогенеза в различных регионах мозга. Эта стратегия способствует передовые методы таргетинга интерес клетки в эмбриональном мозге и траCING схемы формирования на различных стадиях развития.

Introduction

Задний мозг представляет одного из ключевых узлов реле нервной системы, общаясь между центральной и периферической нервной системы с помощью восходящих и нисходящих нейронных сетей. Он регулирует основные функции, включая дыхание, сознание, слуха, координации движений и 1-3. Во время раннего эмбрионального развития, заднего мозга позвоночных временно разделена по его передне-задней (AP) оси в повторяющихся ромбомеры, в которых различные типы клеток нейронов формируются и создания нескольких центров ядер ствола мозга 4. Задний мозг также разделен вдоль его спинной-вентральной (DV) оси в базальной и крыльев пластины, на которой дискретных нейронных предшественников стать указан и дифференцироваться в различных местах DV 3,5,6. Как раннее AP и DV-конкретные нейронные паттерны, регулирующие создание функциональной схемами мозга в значительной степени неизвестно.

Чтобы получить знания по этой фундаментальнойВопрос, инструменты необходимы для того, чтобы обозначить конкретные группы нейронов в мозге и ранней проследить их аксональное траекторий и связи на более поздних стадиях. Ранее мы уже использовали конкретных элементов усилителя, и Cre / LoxP основе системы условного выражения для отслеживания траектории аксональное задних спинальных интернейронов в начале куриного эмбриона 7-9. В текущем рукописи мы нацелены на заднем мозге и модернизированные экспериментальной парадигмы для маркировки поздних эмбриональных интернейронов заднего мозга, аксоны и их синаптических целей, с использованием модифицированной стратегии электропорации и PiggyBac – опосредованного переноса ДНК. Наши новые стратегии позволяет пометки различных подтипов нейронов в одну сторону заднего мозга и отслеживание их аксонального проекции и синаптической сайтов на различных стадиях эмбриогенеза, от 2 до 12 дней после электропорации. На основе этого метода, мы обозначили наиболее спинно-подгруппе интернейронов заднего мозга (dA1/Atoh1 + </sдо> клетки) и выявили две противоположной восходящей аксональное проекции моделей, каждая вытекает из другого места АП и удлиняется в отдельном канатика. dA1 аксоны были обнаружены проекта и форма синапсов в слуховых ядер среднего мозга и в несколько слоев мозжечка 10.

Сочетание электропорации цыпленок, генетические отслеживания нейронов и анализ проекции места на гораздо поздних стадиях развития предоставляет уникальную платформу для изучения формирования нейронных сетей в мозге и выяснить молекулярные механизмы, которые управляют схемой формирования.

Protocol

1. Hindbrain Электропорацию 1.1 обработки яйца Место яйца горизонтально в увлажненном инкубаторе (37-38.5 ° C). Эмбрионы электропорации после 65-70 ч инкубации, когда они достигают 16-17 (HH) этапе (25-30 сомитами). Удалите яйца из инкубатора, они остаются в горизонтальном положени…

Representative Results

Этот протокол был недавно использован, чтобы раскрыть аксонов модели и проекции сайтах dA1 подгруппе интернейронов в заднем мозге цыпленок 10. Чтобы специфично метить эти аксонов, энхансер (Atoh1), который ранее был охарактеризован как специфичные для нейронов спинного dI1 8,12,13, б…

Discussion

В ово электропорации является выполнимой, надежный и эффективный инструмент для изучения спецификации клеток и аксонов во куриных развития нервной системы 20. В этом протоколе мы опишем способ электропорации у кур на заднем мозге E2.75 использованием усилителя элементы, котор…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Мы благодарим доктора Юваль Gottlieb-Дрор для электропорации иллюстрации. Эта работа была поддержана грантами для DSD из Национального института Psychobiology в Израиле и из Нижней Саксонии-израильской программы научно-исследовательское сотрудничество и гранты для AK от Израиля научный фонд, Министерство здравоохранения Израиля и Центр повышения квалификации-Наследие Наследие Биомедицинские партнерства науки.</p>

Materials

Name of Reagent/Equipment Company Catalogue Number
L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes BTX, Harvard Apparatus 45-0162
pulse generator, ECM 830 BTX, Harvard Apparatus 45-0002
OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound Tissue-Tek Sakura 4583 O.C.T. Compound
Nail Polish From Any Commercial Supplier

References

  1. Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
  2. Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
  3. Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
  4. Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
  5. Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
  6. Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
  7. Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
  8. Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
  9. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
  10. Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
  11. Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
  12. Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
  13. Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
  14. Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
  15. Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
  16. Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
  17. Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
  18. Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
  19. Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
  20. Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
  21. Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
  22. Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
  23. Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
  24. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).

Play Video

Cite This Article
Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (75), e50136, doi:10.3791/50136 (2013).

View Video