분리 및 문화 신생아 마우스 심근
Summary
기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다.
Abstract
교양 신생아 심근 긴 myofibrillogenesis와 근원 섬유의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 배양 심근 쉽게 조사 및 조작 생화학 경로, 그리고 자발적으로 심근 박동의 생 역학적 특성에 미치는 영향에 대해 수 있습니다.
다음 2 일간의 프로토콜은 신생아 마우스 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 우리는 쉽게, 신생아에서 마음을 해부 심장 조직을 떼어 놓다 및 심장 세포 집단에서 심근을 풍부하게하는 방법을 보여줍니다. 우리는 세포 분리에 대해 서로 다른 효소 혼합물의 사용, 세포 생존 능력에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 고립 된 심근 이후에 형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 또는 생체 역학 분석의 다양한 사용할 수 있습니다. 우리는 단지 시판되는 용액을 사용하여, 견고성과 재현성을위한 프로토콜을 최적화 효소 혼합물이 SH오우 작은 로트의 변화. 우리는 또한 심근의 분리 및 문화와 관련된 일반적인 문제를 해결하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.
Introduction
쥐의 심장 세포의 성공적인 해리와 문화에 대한 최초의 보고서는 다시 1960 년대 1, 2로 거슬러 올라갑니다. 그렇다하더라도, Harary 및 팔리 배양 심근는 "주기적인 수축의 요구 사항의 연구를위한 독특한 시스템을 제공 할 수있다 [월] [치는] 프로세스의 다양한 대사 경로의 기여를 결정하는 수단을 제공하는"것으로 나타났습니다. 젊은 쥐, 원래의 프로토콜에서 Harary 및 팔리 격리 배양 심근 수년에 걸쳐 적응 많은 과학자들에 의해 수정되었지만, 일반적으로 분리 및 배양 과정은 크게 변경되지 않았습니다. 그러나, 더 나은 효소 3, 표준화 된 솔루션 4,5 및 분리 절차 동안 6-9 세포를 보호하기 위해 가역 채널 및 미오신 ATPase의 억제제 BDM의 첨가는 크게 휴대 수율 및 생존을 개선했다.
신생아 cardiomyo 대 성인cytes
신생아 생쥐 나 쥐에서 분리 배양 심근 성인 심근의 문화에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 성인 마우스 또는 쥐 10에서 심근의 분리에 비해 제일, 신생아 마우스 또는 쥐 마음의 분리 절차는 쉽고 적은 비용이다. 신생아 심근 크게 세포 수율을 증가하고, 분리 한 후 칼슘 함유 배지에 재 도입에 훨씬 덜 민감하다. 성인 심근는 일반적으로 수축을 유도하기 위해 서성 필요로하지만 일반적으로, 자발적으로 도금 한 후 세포를 20 시간을 치고 결과 재분화주기 – 또 다른 큰 장점은 신생아 마우스의 심근이 더 빠른 탈분화를 받아야한다는 것입니다. 성인 심근는 형질 전환 DNA의 성공적인 전달을 위해 바이러스 성 벡터를 필요로하는 반면 신생아 심근은 더 쉽게 또한 리포좀 형질 전환 방법과 형질이다. 신생아 심장 근세포 대조적의, 성인 쥐 심근 11-13의 문화는 근원 섬유 저하 및 수축성 장치의 궁극적 인 회복의 조사를 할 수 있습니다. 성인 심근에서 이러한 특성을 형태 학적 변화는 1-2 주 기간에 걸쳐 발생합니다. 탈분화 – 재분화주기함으로써 인간의 심근 병증이 14에서 관찰 된 병리학 적 변화를 흉내 낸, 태아 유전자 프로그램의 reexpression 함께합니다. 신생아 심근 세포의 배양을 통해 성숙한 래트 심근 세포의 또 다른 장점은 오랜 시간 동안 배양 할 수있는 능력이 세포이다.
마우스 심근 대 쥐
쥐 신생아 심근의 분리 및 배양 가능한 세포의 높은 수율 증가 형질 전환 속도 등의 마우스 신생아 심근의 그 이상 몇 가지 장점이 있습니다. 그러나, 심장 질환에 대한 유전자 변형 마우스 모델의 광범위한 사용 (예를 들어 </ 엠> 확장 성 심근증 15 모델과 근육 임 단백질 녹아웃 마우스) 신생아 쥐에서 유래 심근 세포의 분리 절차의 적응되었다. 신생아 래트 심근 세포 및 마우스를 분리하는 데 사용되는 프로토콜은 거의 동일하지만, 그레이트 손질 후자위한 적절한 효소 믹스의 선택에주의해야한다. 사실, 신생아 마우스의 심근이 감소 된 세포 수율과 생존의 결과로, 일반적으로 overdigestion에 더 취약합니다. 신생아 생쥐 유래 심근 신생아 래트 심장 유래의 세포에 비해 다소 작은 때문에 또한, 도금 밀도는 조정되어야한다.
형태 학적, 전기 생리학, 생화학, 세포 생물학 및 생체 역학 매개 변수뿐만 아니라 myofibrillogenesis의 프로세스의 조사를 위해 많은 용도로, 배양 신생아 심근는 연구를위한 가장 다양한 시스템 중 하나가되고 있습니다체외에서 심장 세포 기능. 성공적인 분석의 첫 번째 단계는하지만, 신생아 마우스 심근를 분리 할 수있는 쉽고 안정적인 방법에 따라 달라집니다. 우리의 프로토콜은 다양한 소스에서의 방법론을 그리고 재현성 및 안정성을 위해 최적화되었다. 우리는 심근 세포 수율과 생존에 영향을 미치는 요인에 대해 설명하고, 분리 및 배양 조건의 최적화를위한 다양한 옵션을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
심장 질환을 연구하는 동물 모델의 사용은 심장 혈관 연구에서 표준이되었습니다. 이 모델의 가까이 생화학 적 특성 (즉, 생화학 적 또는 생체 역학적 인 자극에 심장 세포의 직접 응답을 공부)은 일반적으로 심장 조직이나 심근의 분리가 필요합니다. 심장의 생리적 반응을 조사 연구는 생체 (예를 들어 40 아세틸 콜린, 또는 허혈 – 재관류 시나리오 41)은 일반적으로 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 교수의 명예 장 클로드 Perriard과 에블린 Perriard 신생아 쥐와 쥐 심근을위한 절연 기술에 도입 (기술, 스위스 스위스 연방 공업 대학)에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 그들의 지원을 위해 교수 후아 첸 교수 실비아 에반스 (UCSD, 미국)에게 감사의 말씀을 전합니다. EE의 실험실에서 작업 MRC 경력 설립 교부금에 의해 투자되었다. SL은 NIH / NHLBI (HL107744)에서 독립 수상에 K99/R00 경로에 의해 지원된다. TMM은 미국 심장 협회 (American Heart Association, 11POST7310066)에서 박사 학위 취득 후 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
| Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
| 1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
| 1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
| 1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
| HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
| DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
| M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
| fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
| horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
| Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
| AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
| phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
| 0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
| 3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
| cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
| syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
| straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
| curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
| Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
| perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
| Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
| Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
| 50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
| 15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
| 20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
| 10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
| 30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
| 30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
| 10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
| Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|
References
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